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實(shí)驗(yàn)五    聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

一、實(shí)驗(yàn)原理

       聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PoLymerase chain reaction, PCR）是一項(xiàng)體外特異擴(kuò)增特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一次創(chuàng)舉。

       PCR通常需要兩個(gè)位于待擴(kuò)增片段兩側(cè)的寡聚核苷酸引物，這些引物分別與待擴(kuò)增片段的兩條鏈互補(bǔ)并定向，使兩引物之間的區(qū)域得以通過(guò)聚合酶而擴(kuò)增。反應(yīng)過(guò)程為首先必須使得待擴(kuò)增DNA（稱(chēng)為模板）置于高溫下解鏈成單鏈模板，這一過(guò)程叫變性；第二步為分別與待擴(kuò)增的DNA片段兩條鏈的3’端互補(bǔ)的人工合成的寡聚核苷酸引物（Primer 15-20bp）在低溫條件下分別與模板兩條鏈兩側(cè)互補(bǔ)結(jié)合，這一過(guò)程叫退火，第三步是DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下將脫氧核苷酸（dNTP：dATP, dCTP, dTTP dGTP）沿引物5’—3’方向延伸合成新股DNA，這一過(guò)程叫延伸。變性—退火—延伸，如此循環(huán)往復(fù)，每一循環(huán)產(chǎn)生的新股DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物是以指數(shù)方式即2ⁿ擴(kuò)增的，經(jīng)過(guò)30-35個(gè)循環(huán)，目的片段可以擴(kuò)增到一百萬(wàn)倍，在一般PCR儀上，完成這樣的反應(yīng)需幾個(gè)小時(shí)。

PCR原理示意圖

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．在冰上，建立如下PCR反應(yīng)體系，在PCR管內(nèi)分別加入：

          10×PCR緩沖液            2μL

             25mM dNTPS             1.6μL

          2．5mM MgCl₂           1.2μL

             Primer 1（10μM）      0.8μL

             Primer 2（10μM）      0.8μL

      模板DNA（1μg/μL）  1μL

          Taq酶（5Μ/μL）        0.2μL

             dd H₂O                      12.4μL

                 總體積                  20μL

2．將PCR管放入PCR儀中，按如下程序操作。

    ①94℃預(yù)變性2min (開(kāi)始時(shí)模板DNA變性要適當(dāng)延長(zhǎng))

    ②94℃變性1 min → 36℃退火1 min → 72℃延伸2 min,共40個(gè)循環(huán)

    ③72℃延伸7 min（最后一次延伸的時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)）

    ④4℃貯存。

    3．取1—5μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

三、PCR優(yōu)化

       要得到預(yù)期的PCR擴(kuò)增效果，從中選定最為適用、重復(fù)性最好的條件，要試用不同的反應(yīng)組分和循環(huán)參數(shù)，其中Mg²⁺濃度、dNTP濃度、模板DNA含量和Taq酶含量等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有很大影響，在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)分別進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)和交互組合實(shí)驗(yàn)，最終確定優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系。

四、所需儀器、耗材

       1．微量移液槍

       2．微量移液槍頭

       3．PCR管

       4．PCR儀

       5．離心機(jī)

       6．離心管

       7．玻璃器皿

五、所需試劑

       1．隨機(jī)引物（Primer）（10μM）

       2. dNTP         (25mM)

       3. 模板DNA（1μg/μL）

       4．Taq    DNA聚合酶（5Μ/μL）

       5. 10×PCR緩沖液

       6．TBE

       7．加樣緩沖液

       8．MgCl₂（25mM）

六、試劑配制

       1．瓊脂糖凝膠電泳所需試劑同實(shí)驗(yàn)四一樣。

       2．引物的配制：

       訂購(gòu)的引物大多為干粉，附在管壁上，打開(kāi)時(shí)極易散失，所以打開(kāi)管子前先離心，然后再慢慢打開(kāi)管蓋，溶解、調(diào)整濃度后，蓋上管蓋，充分上下振蕩5—10分鐘，不用時(shí)在-20℃以下保存。

       在干粉管上一般都標(biāo)有260nm下的吸光值，并標(biāo)出堿基對(duì)數(shù)，例如一個(gè)管標(biāo)為5 OD的20 mer oLigo DNA意思為一個(gè)20bp, 260nm下吸光值為5 OD的寡聚DNA。

       分子量（MV）=（A堿基數(shù)×312）+（C堿基數(shù)×288）+（G堿基數(shù)×328）+（T堿基數(shù)×303）-61

分子量也可以用以下近似方法計(jì)算：

       一個(gè)脫氧核苷酸堿基的平均分子量近似為324.5，則一個(gè)引物的分子量=堿基數(shù)×324.5

       例如：現(xiàn)有一個(gè)引物管標(biāo)為0.2 OD 10 mer如配制引物濃度為10μM,方法如下：

       分子量=10×324.5=3245

       質(zhì)量數(shù)=0.2×33=6.6μg  (1 OD ssDNA=33μg)

       摩爾數(shù)=6.6μg/3245=0.002 μmoL=2 nmoL

              （2 nmoL/10μM）×1000=200μL

       所以應(yīng)加200μL水，此管引物才能調(diào)整為10μM。

七、思考題

1．  PCR的反應(yīng)原理是什么？

2．  PCR反應(yīng)體系包括那些成分？

實(shí)驗(yàn)六  隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA反應(yīng)（RAPD）

一、相關(guān)知識(shí)

    遺傳標(biāo)記（genetic markers）是研究生物遺傳變異規(guī)律及其物質(zhì)基礎(chǔ)的重要手段。其方法主要有4種類(lèi)型，即形態(tài)標(biāo)記（morphological markers）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological markers）、生化標(biāo)記（biochemecal markers）和分子標(biāo)記（molecular markers）。與前三種標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有以下優(yōu)越性：（1）直接以核酸作為研究對(duì)象，在植物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)，不受季節(jié)、環(huán)境限制，與發(fā)育時(shí)期無(wú)關(guān)，可用于植物基因型的早期選擇。（2）標(biāo)記數(shù)量極多，遍及整個(gè)基因組。（3）多態(tài)性高，由于自然存在著許多等位變異，不需專(zhuān)門(mén)創(chuàng)造特殊的遺傳材料。（4）由許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性（codominance），能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，可提供完整的遺傳信息。

目前，常用的分子標(biāo)記技術(shù)主要有限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）、染色體或基因組原位雜交（genomic in situ hybridization，GISH）、mRNA差別顯示（mRNA differential display，mRNA-DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、消減雜交法（subtractive hybridization，SH）、代表性差異分析法（representation difference analysis，RDA）、任意引物PCR（arbitrary-primer PCR，AP-PCR）、DNA擴(kuò)增指紋（DNA amplified fingerprinting，DAF）、單引物擴(kuò)增反應(yīng)（single primer amplification reaction，SPAR）、順序表達(dá)位點(diǎn)擴(kuò)增（sequenced characteried amplified region，SCAR）、加錨微衛(wèi)星寡核苷酸（anchored microsatellite oligonucleotide，AMO）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequence-tagged site，STS）等等。

一、實(shí)驗(yàn)原理

RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，它是利用一系列（通常數(shù)百個(gè)）不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈（通常為十聚體）為引物，模板在92-94℃變性解鏈后，如果雙鏈DNA分子在一定長(zhǎng)度內(nèi)具有反向平行又與引物互補(bǔ)的片段，引物的位置是在彼此可擴(kuò)增的距離內(nèi)（引物間距為200-2000bp），那么不連續(xù)的分子量為200-2000bp的DNA片段就會(huì)通過(guò)PCR產(chǎn)生。高溫變性、低溫退火、適度延伸，如此往復(fù)循環(huán)，經(jīng)過(guò)30～40個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物即可擴(kuò)增到百萬(wàn)倍以上，如此高產(chǎn)的DNA片段經(jīng)電泳分離和EB染色后，直接在紫外觀察和照相。

RAPD技術(shù)簡(jiǎn)單、容易掌握，在短期內(nèi)可獲得大量的遺傳標(biāo)記，這些優(yōu)點(diǎn)逐漸被人們接受后，發(fā)展神速，短短三年中在生物學(xué)的諸多領(lǐng)域，如遺傳指紋作圖、檢測(cè)遺傳多樣性與穩(wěn)定性（品種鑒定、物種起源與進(jìn)化）等。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）DNA的提取

      同前CTAB法。

（二）純度檢測(cè)及濃度調(diào)整

      同實(shí)驗(yàn)四。

（三）操作程序

1．反應(yīng)體系的制備

冰上建立如下反應(yīng)體系，夾取一支PCR管，分別加入下列成分：

10×PCR Buffer               2.0 μl

模板DNA（500ng/μl）        1.0 μl

dNTPs（2.5mM）             1.6 μl

MgCl₂ （25mM）            2.0 μl

Primer（20μM）             1.2 μl

Taq酶（2.5U/μl）            0.5 μl

        加ddH₂O至總體積            20.0 μl

    上下吸打混勻，離心收集。礦物油封蓋。

2．?dāng)U增程序

然后將PCR管放入PCR儀中，按如下程序操作。

94℃，預(yù)變性5min；94℃變性1min，37℃退火1min，72℃延伸2min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

3．瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

    方法同實(shí)驗(yàn)三，膠濃度為2%。

四、反應(yīng)的影響因素及注意事項(xiàng)

（一）影響因素

在RAPD反應(yīng)過(guò)程中，涉及的反應(yīng)因子很多，且對(duì)反應(yīng)條件敏感，任何一個(gè)反應(yīng)因子設(shè)置不當(dāng)，都會(huì)影響整個(gè)反應(yīng)的過(guò)程，或者改變帶型。通常情況下，實(shí)驗(yàn)室要系統(tǒng)地探索各反應(yīng)條件及影響因子，優(yōu)化反應(yīng)體系，得到一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件標(biāo)準(zhǔn)的RAPD反應(yīng)。

反應(yīng)過(guò)程中的影響因子主要有Taq酶、Mg²⁺濃度、擴(kuò)增反應(yīng)溫度和時(shí)間、循環(huán)周期、引物、dNTPs濃度和DNA濃度及純度等。因而在實(shí)驗(yàn)前要對(duì)反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件進(jìn)行充分的優(yōu)化。

（二）注意事項(xiàng)

1．冰上配制PCR反應(yīng)液，然后置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。

2．DNA質(zhì)量要求高，應(yīng)純化并特別注意防止氧化。

3．反應(yīng)靈敏，易產(chǎn)生污染而造成假陽(yáng)性，因此要有對(duì)照反應(yīng)。

4．注意影響因素，并注意“平臺(tái)效應(yīng)”的產(chǎn)生。

5．若產(chǎn)物的特異性較低，則可在反應(yīng)混合物中加入5%的二甲基亞礬（DMSO）等以提高產(chǎn)物特異性。

6．如若產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分辨率較低，則可用聚丙烯酰胺凝膠或梯度凝膠電泳方法來(lái)提高分辨率。

五、所用儀器、耗材

PCR儀；微量移液器；離心機(jī)；紫外分析儀；電泳裝置；PCR管；無(wú)菌Tip頭；玻璃器皿等

六、所需試劑

10×PCR Buffer；模板DNA；dNTPs（2.5mM）；MgCl₂ （25mM）；隨機(jī)引物（20μM）；Taq酶（2.5U/μl）；加樣緩沖液；瓊脂糖等。

七、思考題

1．試述RAPD技術(shù)與PCR技術(shù)的區(qū)別。

2．試述為什么RAPD技術(shù)重復(fù)性較差？

實(shí)驗(yàn)七   甜菜M14品系AFLP分析

一、相關(guān)知識(shí)

（一）基因組DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切

在基因工程技術(shù)中，酶切反應(yīng)為一個(gè)關(guān)鍵性的操作過(guò)程，選擇合適的限制性?xún)?nèi)切酶，將載體切成符合要求的片段，以便于外源基因的插入。核酸內(nèi)切酶就是從DNA鏈的內(nèi)部進(jìn)行切割的酶。核酸內(nèi)切酶分為兩類(lèi)，一類(lèi)稱(chēng)為非限制性?xún)?nèi)切酶，另一類(lèi)稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切酶。非限制性?xún)?nèi)切酶就是指那些不識(shí)別特定的DNA序列進(jìn)行切割的內(nèi)切酶，如脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ），是從牛的胰腺中提取出來(lái)的內(nèi)切酶，DNase Ⅰ對(duì)單、雙鏈DNA都很敏感。它可以在DNA鏈內(nèi)的任意位置切斷磷酸二酯鍵，沒(méi)有特定的識(shí)別序列。一般說(shuō)來(lái)，經(jīng)DNase Ⅰ酶解處理過(guò)的DNA體系中最終只會(huì)剩下被降解下來(lái)的單核苷酸和很短的寡聚核苷酸鏈。

限制性?xún)?nèi)切酶則與非限制性?xún)?nèi)切酶相反。它們都能識(shí)別一定的DNA序列，在一定的條件下切斷DNA鏈。限制性?xún)?nèi)切酶分成三種類(lèi)型，即類(lèi)型Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別的DNA序列長(zhǎng)約十幾個(gè)核苷酸，或甲基化，或在離該識(shí)別序列一端約1000bp的位置上切割DNA，類(lèi)型Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶只特定地識(shí)別DNA序列，而切割位點(diǎn)卻不特定；類(lèi)型Ⅲ限制性?xún)?nèi)切酶與類(lèi)型Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶有些不同，它也可識(shí)別特定的DNA序列，但它切割DNA的位點(diǎn)，往往在識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)很相鄰的位置上而不是1000bp那么遠(yuǎn)；盡管如此，它的切割位點(diǎn)仍就不特異。因而Ⅰ型限制性?xún)?nèi)切酶與 Ⅲ 型限制性?xún)?nèi)切酶在基因操作技術(shù)中的應(yīng)用前景并不廣泛。類(lèi)型Ⅱ限制性?xún)?nèi)切酶不但能特異識(shí)別DNA序列，而且識(shí)別的DNA序列與酶切割DNA的位置是一致的，它避免了酶切末端的不確定性和可重復(fù)性，因而在基因重組技術(shù)中有廣泛使用。大多數(shù)的限制性?xún)?nèi)切酶并不是在DNA兩條鏈的同一個(gè)位置切斷的，而是兩條鏈錯(cuò)開(kāi)兩至四個(gè)核苷酸斷裂，這樣產(chǎn)生的DNA末端會(huì)帶有5′突出或是3′突出的DNA單鏈，這種末端稱(chēng)為粘性末端。

酶切通常根據(jù)操作目的的不同而選擇不同的酶切方式，如單酶切、雙酶切、部分酶切等等。單酶切是DNA片段化最常用的方法，用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA樣品。而雙酶切的兩種限制性核酸內(nèi)切酶可以先后分別在不同的反應(yīng)系統(tǒng)中切割DNA樣品。采用這種方法，應(yīng)先用需要較低鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割，然后調(diào)節(jié)緩沖液的鹽濃度，再加入需要較高鹽濃度緩沖液的酶進(jìn)行切割。如果兩種限制性核酸內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，則應(yīng)先用最適反應(yīng)溫度較低的酶進(jìn)行切割，升溫后再加入第二種酶進(jìn)行切割。若兩種限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)相差很大，會(huì)明顯影響雙酶切結(jié)果，則可以在第一種酶切割后，經(jīng)過(guò)凝膠電泳回收需要的DNA片段，再選用合適的反應(yīng)系統(tǒng)，進(jìn)行第二種限制性核酸內(nèi)切酶的切割。

（二）粘性末端的連接

在細(xì)胞中，行使連接功能的是連接酶（ligase），這是一類(lèi)很特殊的酶，它催化DNA或RNA相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA單鏈缺口封合起來(lái)。常用的連接酶主要有DNA連接酶和RNA連接酶，其主要作用為間斷修復(fù)功能和連接功能。

理論上講，連接反應(yīng)的**溫度是37℃，因?yàn)樵?/span>37℃時(shí)連接酶的活性最高，但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，37℃時(shí)粘性末端DNA分子形成的配對(duì)結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此，人們需要找到一個(gè)最適溫度，它既要利于最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又要有助于短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。目前，常用的連接溫度為12-16℃。

由于粘性末端比平末端具有更高的連接效率，因此，在做DNA重組連接實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，人們往往優(yōu)先選擇粘性末端連接。但實(shí)際上，并不是所有的連接都已具備了合適的粘性末端，例如大多數(shù)情況下一個(gè)是粘性末端分子，另一個(gè)是平末端DNA，或是兩個(gè)分子分別具有不同的粘性末端等等。在這些情況下，人們可以采用銜接體（linker）技術(shù)、接合體（adaptor）技術(shù)和同聚體（homo polymer）加尾技術(shù)等。

（三）選擇性PCR擴(kuò)增

原理與標(biāo)準(zhǔn)的PCR完全相同，區(qū)別僅在于PCR所用引物不同。標(biāo)準(zhǔn)PCR的引物為已知序列互補(bǔ)的核苷酸順序，而選擇性擴(kuò)增中，針對(duì)中間未知的核苷酸順序人為的在已知順序引物的后面隨機(jī)加上1~3個(gè)堿基（要保證一定的GC含量），這樣只有與隨機(jī)的三個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)的片段才可能從大量的片段中被擴(kuò)增出來(lái)，因而可根據(jù)選擇性堿基的數(shù)目來(lái)控制擴(kuò)增片段的多少，達(dá)到選擇性的目的。

引物的組成：（1）核心堿基序列，該序列與人工接頭互補(bǔ)；（2）限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列；（3）引物3′端選擇堿基。

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳

依據(jù)制備凝膠的材料，凝膠電泳可分成兩個(gè)亞類(lèi)：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA/RNA（5—500bp）****，其分辨力極高，相差1bp的DNA片段就能分開(kāi)，其不足之處為制備和操作較為困難。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為200bp至近50kb的DNA/RNA片段。

常用聚丙烯酰胺凝膠有以下兩種：

（1）用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠

       大多數(shù)雙鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率大略與其大小的1g對(duì)數(shù)值成反比，但遷移率也受其堿基組成和序列的影響，以致大小完全相同的DNA，其遷移率可相差達(dá)10%，這種作用是由于雙鏈DNA在特定序列上形成扭結(jié)而造成的。

（2）用于分離、純化單鏈DNA的變性聚丙烯酰胺凝膠

這些凝膠在一種可以抑制核酸中的堿基配對(duì)的試劑（如尿素或甲醛）存在下聚合，變性DNA在這些凝膠中的遷移速率幾乎與其堿基組成及序列完全無(wú)關(guān)。放射性DNA探針的分離、S₁核酸酶消化產(chǎn)物的分析及DNA測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物的分析，均采用變性聚丙烯酰胺凝膠。

（五）AFLP技術(shù)

1．AFLP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

理論上由于AFLP采用的限制性?xún)?nèi)切酶和選擇性堿基的種類(lèi)、數(shù)目較多，所以AFLP可產(chǎn)生的的標(biāo)記數(shù)目是無(wú)限的；基因型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)非變性PAGE電泳檢測(cè)到的譜帶數(shù)在50～100條之間，所以該技術(shù)是DNA多態(tài)性檢測(cè)的一個(gè)非常有用的技術(shù)；AFLP標(biāo)記是典型的孟德?tīng)柗绞竭z傳；AFLP分析的大多數(shù)擴(kuò)增片段與基因組的單一位置相對(duì)應(yīng)，因此AFLP標(biāo)記可以用于作為遺傳圖譜和物理圖譜的位標(biāo)；AFLP 既可以用于分析不同復(fù)雜程度的基因組DNA，也可用于分析克隆的DNA大片段，因此它不僅是一種DNA指紋技術(shù)，也是基因組研究的一個(gè)非常有用的工具；DN A的隨機(jī)擴(kuò)增，受模板濃度的影響較大，而AFLP的一個(gè)重要特點(diǎn)是對(duì)模板濃度變化不夠敏感。VOs等人在西紅柿的 AFLP分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)模板濃度相差1000倍的范圍內(nèi)，得到的結(jié)果基本一致。只是模板濃度很低時(shí)，譜帶較弱，甚至有缺失；AFLP技術(shù)另一個(gè)重要特點(diǎn)是，在反應(yīng)過(guò)程中，標(biāo)記的引物會(huì)全部耗盡，當(dāng)引物耗盡后，擴(kuò)增帶型將不受循環(huán)數(shù)的影響。由于AFLP對(duì)模板濃度不敏感，這樣利用過(guò)剩的循環(huán)數(shù)，即使模板濃度存在一些差異，也會(huì)得到強(qiáng)度一致的譜帶。因此AFLP技術(shù)能夠檢測(cè)譜帶強(qiáng)度的多態(tài)性。

2．AFLP與其它分子標(biāo)記技術(shù)的比較

每一種分子標(biāo)記都具有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。對(duì)于相同的材料，用不同的分于標(biāo)記揭示的多態(tài)性是存在差異的，一般AFLP的多態(tài)性比率最大，RFLPRAPD次之。Wang等在對(duì)水稻溫敏不育等位系的研究中報(bào)道，三種分子標(biāo)的多態(tài)性比率依次為AFLP〉RAPD〉RFLP（26.67%；4.00%；1.67%）。同時(shí)Lin等在大豆的分析中同樣證明AFLP的多態(tài)性最高。

特性            RFLP        RAPD        AFLP 

分布            普遍         普遍         普遍

可靠性          高           中等         高

重復(fù)性          高           中等         高

遺傳性          共顯性       顯性         顯性或共顯性

多態(tài)性          中等         高           非常高

DNA需求       2－30ng      1-100ng      100ng

放射性          一般有       無(wú)           有或無(wú)

技術(shù)難度        中等         簡(jiǎn)單         中等

樣品生產(chǎn)率      中低         高           非常高

時(shí)間因素        長(zhǎng)           快           中等

與其它分子標(biāo)記相比，AFLP的特點(diǎn)主要表現(xiàn)在它結(jié)合了RFLP及RAPD各自的優(yōu)點(diǎn)，方便快速，只需要極少量DNA材料，不需要Southern雜交，不需要預(yù)先知道DNA的順序信息，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以快速獲得大量的信息。而且再現(xiàn)性高，重復(fù)性好，因而非常適合于品種指紋圖譜的繪制，遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性的研究。在一些多態(tài)性很少而且待測(cè)樣品較少的情況下，用AFLP分析能達(dá)到滿(mǎn)意的結(jié)果。對(duì)高密度基因圖譜的繪制或?qū)δ硞€(gè)基因所在區(qū)域的精細(xì)作圖，AFLP是較為理想的方法。AFLP所產(chǎn)生的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了RFLP、RAPD等，目前被認(rèn)為是DNA指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最為豐富的一項(xiàng)技術(shù)。

3．AFLP技術(shù)的應(yīng)用

AFLP技術(shù)誕生以來(lái)，己廣泛地用于生物的基因組分析。如植物的抗性基因定位及染色體作圖，病原菌的親緣關(guān)系分析。由于它對(duì)基因組的微小變化具有較好的分辨能力，因而它也被廣泛地用于同一病原真菌的營(yíng)養(yǎng)體的親和群及病菌的無(wú)毒基因與病菌的毒性分析。

①AFLP技術(shù)用于細(xì)菌的分類(lèi)和鑒定的研究

ALFP的可重復(fù)性比RAPD要強(qiáng)，在細(xì)菌分類(lèi)方面的適用范圍與RAPD、RFLP和細(xì)菌可溶性蛋白質(zhì)譜相似。但AFLP綜合以上各方法的優(yōu)點(diǎn)，分辨率僅低于全基因組序列分析，穩(wěn)定性強(qiáng)，可提供更為豐富的分類(lèi)信息。

②AFLP技術(shù)用于真菌分類(lèi)研究

AFLP是一種強(qiáng)有力地表示真菌分子特征的新技術(shù)，其操作過(guò)程方便，區(qū)分鑒定結(jié)果可靠，該技術(shù)在病原真菌方面的應(yīng)用己十分引人注目，己發(fā)展出一些實(shí)用的程序來(lái)區(qū)別一些特殊菌株，用于分型、鑒定并研究其親緣關(guān)系。它可以分析其不同種屬間的差別，甚至還可以揭示種內(nèi)不同菌株間的細(xì)微差異，從而彌補(bǔ)了表型分型的不足，更為精確地分析致病真菌本質(zhì)上的差異。該技術(shù)被應(yīng)用于鐮刀菌（Fusarmiu graminearum）不同來(lái)源分離株的鑒定和區(qū)別，得到了良好結(jié)果。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1991年，Gustava等人用非常短的5個(gè)堿基、8個(gè)堿基及10個(gè)堿基的寡核苷酸片段作引物，隨機(jī)擴(kuò)增人、動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌以及病毒DNA獲得成功，他們稱(chēng)之為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplification Fragment Length Polymorphisms，AFLP）。1992年由Zabeau 和Vos創(chuàng)立的AFLP技術(shù)與前述內(nèi)容大不相同，該方法結(jié)合了RFLP(restriction fragment Length polymorphisms)技術(shù)和RAPD技術(shù)的特點(diǎn)，使用人工接頭（Adaptor）與限制性?xún)?nèi)切酶酶切的基因組DNA片段連接并以此為DNA模板，合成系列3`—末端隨機(jī)變化數(shù)個(gè)堿基且與人工接頭序列相互補(bǔ)的PCR引物，來(lái)進(jìn)行PCR特異條件擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)后可獲得DNA指紋圖譜。

基因組DNA

  CTGCAGNNNN…NNNNCTGCAG…

GACGTCNNNN…NNNNGACGTC

PstⅠ酶切

GNNNN…NNNNCTGCA

ACGTCNNNN…NNNNG

              加人工接頭

5’---CTCGTAGACTGCGTACATGCA---3’

                       3’--- CATCTGACGCATGT ---5’

T4連接酶連接

lCTCGTAGACTGCGTACA TGCA GNNNN…NNNNCTGCA

 CATCTGACGCATGT ACGT CNNNN…NNNNG

                    選擇引物PCR擴(kuò)增

CTCGTAGACTGCGTACATGCAGNNNN…NNNNCTGCA

CATCTGACGCATGTACGTCNNNN…NNNNG

Ps1--GACTGCGTACATGCAGACC

Ps2—GACTGCGTACATGCAGCTG

凝膠檢測(cè)

（一）基因組DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切

限制性?xún)?nèi)切酶的作用效率是受多方面因素影響的，如反應(yīng)溫度、緩沖體系、離子種類(lèi)與濃度、DNA的純度、DNA分子的甲基化程度等等。限制性?xún)?nèi)切酶的反應(yīng)緩沖液中一般含有MgCl₂，NaCl或KCL，Tirs-HCl，二硫蘇糖醇（DTT）或β-疏基乙醇，有的還含有牛血清蛋白（BAS）。Mg²⁺是限制性?xún)?nèi)切酶的輔助因子，Tris-HCL保持整個(gè)反應(yīng)體系的pH值；不同的酶對(duì)于Na⁺或K⁺有不同的要求，DTT和β-疏基乙醇有助于酶在體系中的穩(wěn)定。

DNA的純度對(duì)于酶切效果影響很大，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、酚、氯仿、SDS等雜質(zhì)污染DNA以后，能直接抑制酶的活性。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了克服這些雜質(zhì)的影響，采取的措施或者是延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，或是增加酶量，也可以既增加酶量，又延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間取得好的反應(yīng)效果。

不同的限制性?xún)?nèi)切酶，其最適反應(yīng)溫度也可能不同，內(nèi)切酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度為37℃，但也有許多例外，如Sma I 的最適反應(yīng)溫度為25℃，Taq I 的最適反應(yīng)溫度為65℃。內(nèi)切酶的活性定義：在50 μL反應(yīng)液中，適宜的溫度下反應(yīng)1小時(shí)，將1μg的λDNA完全分解的酶量定義為1個(gè)活性單位。

限制性?xún)?nèi)切酶的貯存液通常含有50%的甘油，而甘油在反應(yīng)體系中超過(guò)5%時(shí)，就會(huì)影響酶切的特異性，因此作酶切反應(yīng)時(shí)加入酶的體積不應(yīng)超過(guò)反應(yīng)總體積的1/10。

酶切的時(shí)間因?qū)嶒?yàn)而異，是由DNA樣品的濃度、純度及酶的濃度決定的。DNA樣品濃度高、純度差或酶的濃度太低都可以適當(dāng)延長(zhǎng)酶切時(shí)間。酶切體系的體積一般以20-50 μL為宜。如果DNA樣品是基因組DNA，那么時(shí)間可以延長(zhǎng)至18個(gè)小時(shí)或過(guò)長(zhǎng)。

EcoR Ⅰ：

5′----GAATTC---3′        5′---G            AATTC---3′

3′----CTTAAG---5′        3′---CTTAA            G---5′

Pst Ⅰ:

5′---CTGCAG---3′         5′---CTGCA            G---3′

3′---GACGTC---5′         3′---G            ACGTC---5′

BamH Ⅰ:

5′---GGATCC---3′         5′---G            GATCC---3′

3′---CCTAGG---5′         3′---CCTAG            G---5′

（二）接頭的連接

（三）選擇性PCR擴(kuò)增

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠（poLyacryLamide geL, PAG）是由丙烯酰胺（acryLamide）和交聯(lián)試劑N，N’—甲叉雙丙烯酰胺（Bis；N，N’—methyLenebisacryLamide）在有引發(fā)劑如過(guò)硫酸胺和增速劑如N,N,N’,N’—四甲基乙二胺(TEMED)存在的情況下聚合而成的。丙烯酰胺的單體形成長(zhǎng)鍵，由N,N’—甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團(tuán)和鏈末端的自由功能基團(tuán)反應(yīng)而發(fā)生交朕形成凝膠，凝膠的孔徑由鏈長(zhǎng)和交聯(lián)度所決定。

       聚丙烯酰胺凝膠的制備和電泳都比瓊脂糖凝膠更為費(fèi)事。聚丙烯酰胺凝膠幾乎總是裝于兩塊玻璃板之間，兩塊玻璃板由間隔片隔開(kāi),并封以絕緣膠布。在這種配置的形式下，大多數(shù)丙烯酰胺溶液不會(huì)與空氣接觸，所以氧對(duì)聚合的抑制局限于凝膠頂部的一個(gè)窄層里。聚丙烯酰胺凝膠一律是進(jìn)行垂直電泳，根據(jù)分離的需要，其長(zhǎng)度可以在10—100cm之間。聚丙烯酰胺凝膠與瓊脂糖凝膠相比有3個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)：①分辨力強(qiáng)，長(zhǎng)度僅僅相差0.2% (即500bp中的1bp）的DNA分子即可分開(kāi)；②所能裝載的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠，多達(dá)10μg的DNA可以加樣于聚丙烯酰胺凝膠的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品槽而不致顯著影響分辨力；③從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高，可適用于要求最高的實(shí)驗(yàn)。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）基因組DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切

1．本試驗(yàn)所用DNA為從甜菜葉中提取的基因組DNA，選用三種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行單酶切反應(yīng)，分別為Pst Ⅰ、和BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶。

2．取三個(gè)0.5mL離心管，按順序加入以下成分，反應(yīng)總體積為  20μL。

滅菌水                                      16μL

10×限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液            2 μL

基因組DNA（1mg/mL）           2 μL

限制性?xún)?nèi)切酶                            1 μL

3．上下吸打混勻，快速離心收集使溶液全部聚于管底部，將離心管放在水浴中，根據(jù)不同酶的**作用溫度保溫2.5—4 h。

4．置65℃水浴中滅活15分鐘，終止酶切反應(yīng)。

5．取10 μL酶切過(guò)的溶液，加入2 μL 6×上樣緩沖液在1% 瓊脂糖凝膠上電泳，電泳時(shí)以分子量Marker為分子量對(duì)照，電泳電流為60--100mA。

6．電泳結(jié)束后，在紫外燈下進(jìn)行觀察，酶解完全的總DNA在泳道上應(yīng)呈均勻的彌散狀，其中還經(jīng)?？梢?jiàn)亮一些的條帶，這些是重復(fù)序列。

（二）接頭的連接

1．每種限制性?xún)?nèi)切酶都有各自配對(duì)的接頭，其序列具體如下：

EcoR Ⅰ：

Ead1：    5′--CTC GTA GAC TGC GTA CC--3′      

Ead2：        3′--CAT CTG ACG CAT GGT TAA--5′

Pst Ⅰ：

Pad1：    5′--CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA--3′      

Pad2：        3′--CAT CTG ACG CAT GT--5′ 

BamH Ⅰ：

Bad1：    5′--GGG TCG AAT TCG AGC TCA G--3′      

Bad2：    3′--CCC AGC TTA AGC TCG AGT CCT AG--5′

2．接頭的制備：

①先將接頭中每個(gè)單鏈部分配制成濃度為50μM的溶液，根據(jù)摩爾數(shù)計(jì)算加水量；

②分別從兩管中取25μL溶液加入PCR管中，經(jīng)94℃變性2min，36℃退火5min后，自然冷卻至室溫，兩個(gè)互不寡聚核苷酸鏈便結(jié)合成為人工接頭，做好標(biāo)記備用。

3．制備連接反應(yīng)體系：

取一支PCR管，冰上依次加入下列成分：

酶切模板DNA               250 ng（5 μL）

25μM接頭                   0.2 μL

T₄ Ligation Buffer               5 μL

T₄ Ligase（3U/μL）           0.6 μL

ddH₂O                      39.2 μL

總體積                       50 μL

4．吸打混勻，16℃條件O/N，進(jìn)行連接反應(yīng)。

5．加0.1×TE Buffer至終體積250 μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（三）選擇性PCR擴(kuò)增

1．三種限制性?xún)?nèi)切酶用到的選擇擴(kuò)增引物，其序列具體如下：

EcoR Ⅰ：

Es1：    5′--GAC TGC GTA CCA ATT CGT C--3′      

Es2：    3′--GAC TGC GTA CCA ATT CAG C--5′

Pst Ⅰ:

Ps1：    5′--GAC TGC GTA CAT GCA GCT G--3′      

Ps2：    3′--GAC TGC GTA CAT GCA GAC C--5′

BamH Ⅰ:

Bs1：    5′--TTC GAG CTC AGG ATC CGT G--3′      

Bs2：    3′--    GAG CTC AGG ATC CAC G--5′

2．選擇引物的制備：

使用前根據(jù)摩爾數(shù)將引物配制成終濃度66 ng/μL，備用。

3．制備PCR反應(yīng)體系：

取一支PCR管，冰上依次加入下列成分：

10×PCR Buffer                   2.0 μL

2.5 mM dNTP                    1.6 μL

25  mM MgCl₂                    1.2 μL

選擇引物                        1.0 μL

TaKaRa Ex Taq（5U/μL）          0.2 μL

連接模板DNA                   10.0 μL

ddH₂O                           4.0 μL

總體積                          20 μL

4．吸打混勻，離心收集。

5．PCR儀擴(kuò)增，循環(huán)程序如下：

        94℃，5 min

        94℃，30 sec

        68℃，30 sec（每個(gè)循環(huán)降低0.7℃）    12 Cycles

        72℃，1 min

        94℃，30 sec

        56℃，30 sec      23 Cycles

        72℃，1 min

        72℃，5 min

        4℃保存，Hold。

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

1．已商品化的電泳裝置有多種類(lèi)型，而玻璃板與間隔片之間的配置也因制造廠商的不同而略有差異，間隔片的厚度介于0.5—2.0mm。凝膠越厚，電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量就越大,過(guò)熱會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)“微笑”DNA條帶或其他問(wèn)題，因此，凝膠薄一點(diǎn)更好。在玻璃板與間隔片之間要形成不透水密封，以免未聚合的凝膠溶液漏出。一般兩塊玻璃板的大小略有差別。本實(shí)驗(yàn)所用的電泳槽為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY—III 28D型電泳槽。實(shí)驗(yàn)前，把玻璃板及橡膠框要徹底清洗，然后分別把兩塊玻璃板插入橡膠框中，其中小玻璃板插入帶有下凹槽的縫中。用瓊脂糖（1~1.2%）將大、小玻璃板的底部封住。一個(gè)電泳槽有兩個(gè)這樣的橡膠框。

       2．將載有玻璃板的兩個(gè)橡膠框分別放入電泳槽的夾隔中，其中短玻璃一面向內(nèi)，固定位置，擰緊兩側(cè)及底部的螺絲。

       3．拿兩個(gè)50mL小燒杯，按下表分別配制40mL的聚丙烯酰胺凝膠溶液。在配制聚丙烯酰胺凝膠溶液時(shí)，可以先把水、40%丙烯酰胺、5×TBE和10%過(guò)硫酸胺混合，等到灌膠前再加入TEMED，否則凝膠要很快聚合。

4．將電泳槽斜靠在一白色瓷盤(pán)邊上，與桌面大約成10—20°角，向混合液中加入TEMED，旋動(dòng)燒杯以混勻溶液。

5．將燒杯中的溶液沿下方的橡膠框中的長(zhǎng)玻璃液一側(cè)倒入兩塊玻璃板的空隙處，注滿(mǎn)至頂部，如有氣泡，用一細(xì)棒將其排出。

6．立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，梳子平的一?cè)要靠近長(zhǎng)玻璃板。

7．將電泳槽反轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，使另一個(gè)沒(méi)有灌膠的橡膠框處在下方，用同樣方法灌膠。

8．將電泳槽放正，在室溫下聚合60分鐘。如果凝膠明顯收縮，應(yīng)補(bǔ)加丙烯酰胺溶液。聚合完全后，在梳子下方可以看見(jiàn)折射率不同的紋線。

9．如果不接通冷卻水循環(huán)裝置，應(yīng)用夾子夾緊連接貯液槽的兩根橡膠管。

10．凝膠聚合完畢后，小心取出梳子，立即用水沖洗加樣孔，用1×TBE灌滿(mǎn)電泳槽的緩沖液槽。

11．接上電極，上貯液槽導(dǎo)線與電泳儀的負(fù)極相連（黑對(duì)黑），下貯液槽導(dǎo)線與電泳儀的正極相連（紅對(duì)紅），設(shè)定電壓及電流，按下電泳儀的工作開(kāi)關(guān)，進(jìn)行預(yù)電泳20—30分鐘以除去加樣孔處的雜質(zhì)。

12．將工作開(kāi)關(guān)放到預(yù)置擋的位置，將DNA樣品與適量的凝膠加樣緩沖液混合，用移液槍吸取混合液，將Tip頭靠近加樣孔對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)玻璃板注入樣品。

13．設(shè)定好電壓及電流(一般設(shè)置恒流30 mA，亦可在200V)，按下電泳儀的工作開(kāi)關(guān)，進(jìn)行電泳（大約3—4個(gè)小時(shí)）。

14．電泳至標(biāo)準(zhǔn)參照前沿指示劑位置時(shí)，切斷電源，撥出導(dǎo)線，棄去緩中液槽內(nèi)的電泳緩沖液，擰開(kāi)固定螺絲，卸下玻璃板和橡膠框，用薄鋼勺將上面的玻璃板從一角撬起，用洗瓶沖洗凝膠，使凝膠完全附在一個(gè)玻璃板上，再用洗瓶沖洗凝膠與玻璃板的空隙，使凝膠徹底與玻璃板分離，用水的力量把凝膠沖入白瓷盤(pán)中，（在此過(guò)程中，切勿用手及其它工具接觸凝膠）。

15．用去離子水清洗凝膠3次，然后放入固定液中（固定液的體積以沒(méi)過(guò)膠面0.5cm為宜）固定10分鐘。

16．倒掉固定液，用去離子水清洗凝膠3次，然后放入染色液染色10分鐘。

17．倒掉染色液，用去離子水清洗凝膠3次，然后放入顯影液中顯影10—20分鐘。

18．等到DNA條帶清晰顯現(xiàn)出來(lái)時(shí)，凝膠再用清水沖洗一遍，然后用10%甘油浸泡過(guò)的玻璃紙包好（不要有氣泡），用夾子固定在玻璃板上，在室溫下自然封干一夜，封干后取下干膠，進(jìn)行區(qū)帶分析。

19．觀察記錄，結(jié)果分析。

四、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

1．酶切時(shí)一般的加樣次序?yàn)樗?/span>buffer、DNA，最后加酶液。

2．酶切反應(yīng)為微量操作，Tip要從溶液表面吸取，以防止Tip沾去過(guò)多液體與酶，待用的內(nèi)切酶要放在冰浴內(nèi)，用后蓋緊蓋子，立即放回－20℃冰箱，防止限制性?xún)?nèi)切酶的失活。

3．由于溫差原因，往往在酶切反應(yīng)的離心管蓋上有水汽，因此樣品酶切完畢或中間取樣要離心2秒，以集中溶液,否則會(huì)發(fā)現(xiàn)酶切后體積減小。

4．若電泳條帶靠近加樣孔的一端比另一端亮得多，表明酶切不完全，這可能是因?yàn)橐韵聨讉€(gè)原因：

①反應(yīng)時(shí)間不夠長(zhǎng)（若反應(yīng)過(guò)夜則可排除此項(xiàng)）。

②酶量不夠或酶部分失活，當(dāng)一管酶加到最后時(shí)常會(huì)碰到后一種情況。

③如果DNA樣品溶于TE緩沖液中且在酶解反應(yīng)中所占的體積較大時(shí)，TE緩沖液中的EDTA可能抑制酶解反應(yīng)，這時(shí)可用乙醇重新沉淀DNA，其步驟為加入1/10體積的3M NaAC，再加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，離心（14000g×15min），去上清，再加入75%乙醇（50 μL）洗DNA沉淀，再離心（14000g×15min），去上清，干燥后重新溶于少量TE緩沖液或SWD中。

5．若泳道中的DNA系帶混雜，可能是由于DNA樣品在初始緩沖液中只是部分溶解或者是因?yàn)橐掖汲恋砗?/span>DNA樣品中仍殘存有乙醇。

6．電泳條帶下部較其他部位亮得多，這可能是因?yàn)闃悠分谢煊?/span>RNA或DNA樣品發(fā)生了降解。

五、所需儀器、耗材

1．30℃、37℃、65℃水浴          2．電泳儀

3．水平電泳槽                    4．垂直板電泳槽

5．移液槍                        6．凍冷離心機(jī)

7．紫外觀測(cè)儀                    8．高壓滅菌鍋

9．紫外凝膠成像系統(tǒng)              10．磁力攪拌器

11．酸度計(jì)                       12．島津紫外分光光度計(jì)

13．超低溫冰箱                   14．純水儀

15．低溫循環(huán)水浴鍋               16．超速離心機(jī)

17．冰箱                         18．鼓風(fēng)干燥箱

19．冷凍干燥離心機(jī)               20．PCR儀

21．離心管                       22．各種細(xì)口瓶及燒杯

23．夾子                         24．玻璃紙

25．洗瓶                         26．單面刀片

27．Tip頭                        28．PCR管

六、所需試劑

1．基因組DNA（1mg/mL）    2．分子量Marker

3．1×TBE配制的1%瓊脂糖    4．溴化乙錠貯液（10mg/mL）

5．滅菌蒸餾水（SDW）       6．限制性?xún)?nèi)切酶及酶切反應(yīng)緩沖液

7．3M  NaAC                8．乙醇

    9．上樣緩沖液                10、Tris-HCl

11．硼酸                     12．EDTA（乙二胺四乙酸）

13．過(guò)硫酸銨                 14．TEMED（N-N-N’-N’-四甲基乙二胺）

15．冰醋酸                   16．硝酸銀

17．氫氧化鈉                 18．甲醛

19．丙烯酰胺                 20．甲叉雙丙烯酰胺（Bis）

七、試劑配制

1．5×TBE

2．0.5moL/L EDTA（pH=8.0）

       在800mL水中加入186.1g EDTA-Na₂·2H₂O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。

3．10% 過(guò)硫酸銨

過(guò)硫酸銨1g定容至10mL或者過(guò)硫酸銨0.1g定容至1mL。

4．TEMED：商品試劑

5．固定液：10%乙醇，0.5% 冰醋酸

      配制：50mL乙醇,2.5mL冰醋酸定容至500mL。

6．染色液： 10%乙醇，0.5%冰醋酸，0.2%硝酸銀

配制：50mL乙醇，2.5mL冰醋酸，1g硝酸銀定容至500mL，避光保存。

7．顯影液：3%氫氧化納，0.5%甲醛

配制：15g氫氧化納，6.8 mL 37% 甲醛定容至500mL。

8．40%丙烯酰胺（19：1）：

  丙烯酰胺38g，甲叉雙丙烯酰胺2g加50mL水將溶液加熱37℃，定容至100mL.

9．1% 瓊脂糖：0.24g瓊脂糖加20mL水，在微波爐中加熱。

八、思考題

1．影響酶切的因素有哪些？

2．酶切反應(yīng)不完全的因素有哪些？

3．簡(jiǎn)單描述粘性末端的三種連接技術(shù)

4．與瓊脂糖凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠主要有哪些優(yōu)點(diǎn)？

5．在制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，過(guò)硫酸胺和N,N,N’,N’—四甲基乙二胺（TEMED)的作用是什么？

6．試比較AFLP技術(shù)與RAPD技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)八 生物信息學(xué)

一、相關(guān)知識(shí)

 （一）生物信息學(xué)的定義

生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。它是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的重大前沿領(lǐng)域之一，同時(shí)也將是21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一。其研究重點(diǎn)主要體現(xiàn)在基因組學(xué)(Genomics)和蛋白學(xué)(Proteomics)兩方面。

 廣義地說(shuō)，生物信息學(xué)從事對(duì)基因組研究相關(guān)生物信息的獲取、加工、儲(chǔ)存、分配、分析和解釋。這一定義包括了兩層含義，一是對(duì)海量數(shù)據(jù)的收集、整理與服務(wù)，也就是管好這些數(shù)據(jù)；另一個(gè)是從中發(fā)現(xiàn)新的規(guī)律，也就是用好這些數(shù)據(jù)。
　　具體地說(shuō)，生物信息學(xué)是把基因組DNA序列信息分析作為源頭，找到基因組序列中代表蛋白質(zhì)和RNA基因的編碼區(qū)；同時(shí)，闡明基因組中大量存在的非編碼區(qū)的信息實(shí)質(zhì)，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳語(yǔ)言規(guī)律；在此基礎(chǔ)上，歸納、整理與基因組遺傳信息釋放及其調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄譜和蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，從而認(rèn)識(shí)代謝、發(fā)育、分化、進(jìn)化的規(guī)律。
　　 生物信息學(xué)還利用基因組中編碼區(qū)的信息進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的模擬和蛋白質(zhì)功能的預(yù)測(cè)，并將此類(lèi)信息與生物體和生命過(guò)程的生理生化信息相結(jié)合，闡明其分子機(jī)理，最終進(jìn)行蛋白質(zhì)、核酸的分子設(shè)計(jì)、藥物設(shè)計(jì)和個(gè)體化的醫(yī)療保健設(shè)計(jì)。

（二）研究生物信息學(xué)的必要性

首先伴隨著基因組研究，相關(guān)信息出現(xiàn)了爆炸性增長(zhǎng)，迫切需要對(duì)海量生物信息進(jìn)行處理。自1995年科學(xué)家破譯了全長(zhǎng)為180萬(wàn)核苷酸的嗜血流感桿菌基因組以來(lái)，到目前已有大約60個(gè)微生物和若干真核生物，如：酵母、線蟲(chóng)、果蠅、擬南芥的完整基因組完成測(cè)序。至2001年的春天，科學(xué)家又公布了人類(lèi)基因組的絕大部分序列，即：人類(lèi)基因組的工作草圖。這些成就意味著基因組的研究將全面進(jìn)入信息提取和數(shù)據(jù)分析的嶄新階段。根據(jù)國(guó)際數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)，1999年12月DNA堿基數(shù)目為30億，2000年4月DNA堿基數(shù)目是60億，現(xiàn)在這一數(shù)目已達(dá)140億，大約每14個(gè)月翻一番。同時(shí)，電子計(jì)算機(jī)芯片對(duì)于數(shù)字處理能力的增長(zhǎng)也相當(dāng)于每18個(gè)月翻一番。因此，計(jì)算機(jī)能夠有效地管理和運(yùn)行海量數(shù)據(jù)。
　　但是，更為本質(zhì)的原因是基因組數(shù)據(jù)的復(fù)雜性。所謂某種生物的基因組就是指該生物所有遺傳物質(zhì)的總和。生物的遺傳物質(zhì)是一類(lèi)稱(chēng)為脫氧核糖核酸（DNA）的生物大分子，它是由4種核苷酸串接起來(lái)組成的，通常用字符A、T、G、C代表。通俗地說(shuō)，生物的遺傳密碼就是這4個(gè)字符連接起來(lái)的線狀長(zhǎng)鏈。這種鏈往往很長(zhǎng)，比如：人的遺傳密碼就含有32億個(gè)字符，將它們堆起來(lái)就構(gòu)成了一部100多萬(wàn)頁(yè)、每頁(yè)有3000字符的“天書(shū)”。這本“天書(shū)”包含了人體的結(jié)構(gòu)和功能以及生命活動(dòng)過(guò)程的大量信息，卻僅僅由4個(gè)字符組成，既無(wú)詞法，又無(wú)句法，還沒(méi)有標(biāo)點(diǎn)符號(hào)，看起來(lái)每一頁(yè)都是相似的。如何讀懂它是個(gè)極大的難題?；蚪M研究最終是要把生物學(xué)問(wèn)題轉(zhuǎn)化成對(duì)數(shù)字符號(hào)的處理問(wèn)題。要解決這樣的問(wèn)題就必須發(fā)展新的分析理論、方法、技術(shù)、工具，就必須依賴(lài)計(jì)算機(jī)的信息處理。

（三） 當(dāng)前主要研究?jī)?nèi)容

1．獲取人和各種生物的完整基因組；
2．發(fā)現(xiàn)新基因和新的單核苷酸多態(tài)性；
3．基因組中非編碼蛋白質(zhì)；
4．在基因組水平研究生物進(jìn)化；

5．完整基因組的比較研究；
6．從功能基因組到系統(tǒng)生物學(xué)；
7．蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬與藥物設(shè)計(jì)；
8．生物信息學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展研究。

二、實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容是將甜菜中的序列表達(dá)標(biāo)簽EST（Expressed sequence taqs）與已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，從而掌握對(duì)未知序列進(jìn)行功能分析的基本方法。

EST是長(zhǎng)約150～500bp的基因表達(dá)序列片段。EST技術(shù)是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并克隆到載體構(gòu)建成cDNA文庫(kù)后，大規(guī)模隨機(jī)挑選cDNA克隆，對(duì)其5′或3′端進(jìn)行一步法測(cè)序，所獲序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列比較，從而獲得對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異、衰老死亡等一系列生命過(guò)程認(rèn)識(shí)的技術(shù)。

將EST序列與GenBank進(jìn)行同源性比較，Score值表示相似性程度，Score值越高，相似性（similarity）越大；E Value值表示隨機(jī)匹配的可能性，E值越大，隨機(jī)匹配的可能性越大；Identity值表示與數(shù)據(jù)庫(kù)序列一致性的百分比；Positives 表示兩條序列氨基酸性質(zhì)相似比例；Gaps比對(duì)時(shí)插入空位的比例；Query為檢測(cè)序列；Subject為數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列。當(dāng)Score≤80時(shí)，表示未知的EST是新的；當(dāng)Score值很高時(shí)，表示未知的EST與相應(yīng)的已知基因有高度的同源性，由此可推測(cè)此EST與已知基因具有相似的功能。

EST序列分析在EST研究中,使用最多的方法就是序列相似性比較，以此來(lái)確定EST的功能。BLAST(Basic Local Alignment Search ToolA)是應(yīng)用較廣的工具軟件之一，為同源分析的軟件包，包括有BLASTN、BLASTP、TBLASTN、TBLATX、BLASTX等5個(gè)軟件。BLASTN是將核酸序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，BLASTP是將氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，TBLASTN是將蛋白質(zhì)序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)所有6種翻譯序列的對(duì)比，TBLASTX是將核酸序列的6種翻譯序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)所有6種翻譯序列的對(duì)比，BLASTX是將核酸序列的6種翻譯序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的對(duì)比。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1．登陸美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI　National center for biotechnology information　)網(wǎng)站，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。點(diǎn)擊BLAST，出現(xiàn)一個(gè)新界面 。

2．在出現(xiàn)的新界面中點(diǎn)擊Nucleotide- nucleotide BLAST(blastn)，進(jìn)入另一界面。

3．在此界面中的search中加入要分析的序列，然后點(diǎn)擊BlAST，在非冗余庫(kù)nr (non redundant)中搜索，出現(xiàn)新界面。

4．新界面會(huì)給出所申請(qǐng)序列的ID號(hào)碼，點(diǎn)擊Format。

5．等候所提示的時(shí)間，系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)一系列與所分析序列同源的已知基因的比對(duì)結(jié)果。

四、所需儀器

   30臺(tái)電腦（可用于上網(wǎng)）。

五、 思考題

1．生物信息學(xué)的定義？

2 .EST的含義？

3．在生物信息學(xué)中BLASTN、BLASTP、TBLASTN、TBLATX、BLASTX所代表的含義？

4 .如何對(duì)未知基因或序列在nr中進(jìn)行生物信息學(xué)的BLAST分析？