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分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

主編：于冰 馬春泉 高傳軍 楊峰山 

主審：李海英

黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

2006 年 3月

目    錄

緒論     分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)安全注意事項(xiàng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需要的儀器設(shè)備 ……………………………………………1

實(shí)驗(yàn)一    植物基因組DNA的分離 ………………………………6

實(shí)驗(yàn)二    RNA的分離 ……………………………………………11

實(shí)驗(yàn)三    DNA/RNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)…………………………15

實(shí)驗(yàn)四    DNA/RNA濃度、純度的測(cè)定及濃度的調(diào)整…………21

實(shí)驗(yàn)五     聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）………………………………24

實(shí)驗(yàn)六    隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA反應(yīng)（RAPD）…………………28

實(shí)驗(yàn)七    甜菜M14品系AFLP分析………………………………32

實(shí)驗(yàn)八    生物信息學(xué)………………………………………………49

前    言

    黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院自成立以來(lái)，相繼成立了生物工程專業(yè)，生物技術(shù)專業(yè)，生物制藥專業(yè)和食品科學(xué)與工程專業(yè)。分子生物學(xué)是一門二十一世紀(jì)的前沿學(xué)科，而實(shí)驗(yàn)操作是分子生物學(xué)的一個(gè)重要組成部分。我們結(jié)合了我院現(xiàn)有的儀器設(shè)備及材料情況，為本科生設(shè)立了八個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（包括一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目） ，以使學(xué)生掌握分子生物學(xué)領(lǐng)域中最基本的實(shí)驗(yàn)技能。本書編寫充分考慮了實(shí)驗(yàn)的系列操作性，比如從基因組DNA、總RNA的提取到瓊脂糖凝膠檢測(cè)，從DNA濃度的調(diào)整到PCR技術(shù)，從分子標(biāo)記技術(shù)到生物信息學(xué)分析等，完全貫穿了分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。對(duì)生命科學(xué)學(xué)院的本科生來(lái)說(shuō)是一本很好的實(shí)驗(yàn)教材。

緒論  分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)安全注意事項(xiàng)及分子生物學(xué)

實(shí)驗(yàn)室所需要的儀器設(shè)備

一、安全事項(xiàng)

    在實(shí)驗(yàn)室中安全是最重要的，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)常與毒性強(qiáng)，甚至致癌的試劑接觸，所以進(jìn)入分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的人員，必須了解所有的安全措施，并將實(shí)驗(yàn)室的操作置于最安全的條件下。下面提到的幾點(diǎn)須特別注意：

1．有毒的化學(xué)試劑

許多溶劑，像氯仿、異戊醇、異丁醇、正丁醇、甲醛和乙醚，應(yīng)在通風(fēng)櫥中使用，并注意保護(hù)衣服、皮膚和呼吸道。另一些試劑有可能是致癌物或誘變劑，像溴乙錠、甲酰胺，焦碳酸二乙酯（DEPC）等，在操作中應(yīng)注意防護(hù)，并注意使用后的處理。各種試劑在使用前都應(yīng)認(rèn)真看一下使用說(shuō)明，特別是對(duì)一些試劑盒，掌握有關(guān)知識(shí)后，方可使用。

2．放射性

有些實(shí)驗(yàn)需要使用³²P或其它放射性物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中要確實(shí)保證遵守使用這類物質(zhì)的所有守則；對(duì)放射性廢棄物也要同樣小心。

3．生物學(xué)管制

雖然現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展已經(jīng)帶來(lái)了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益，生物技術(shù)所具有的巨大力量也給人類社會(huì)帶來(lái)了許多意想不到的沖擊，它既可以造福人類，也可能用來(lái)制造致命的生物武器，破壞整個(gè)人類社會(huì)的和平。1976年6月30日，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院制訂并正式公布了“重組DNA研究準(zhǔn)則”，規(guī)定禁止若干類型的重組DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)外，還制訂了許多具體的條文規(guī)定。這些規(guī)定主要包括對(duì)生物體的物理防護(hù)和生物防護(hù)。物理防護(hù)主要是：實(shí)驗(yàn)室必須有技術(shù)熟練的工作人員，具有正確的物理防護(hù)設(shè)備，如負(fù)壓裝置，高壓滅菌及安全操作箱等等。生物防護(hù)主要包括選擇非病原的生物體作外源DNA的克隆工具，或者對(duì)微生物進(jìn)行精細(xì)的遺傳操作，減低其在環(huán)境中存活和繁殖的可能性。

4．設(shè)備方面的危險(xiǎn)

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有設(shè)備都有潛在的危險(xiǎn)，操作方法不正確，就會(huì)出現(xiàn)意外，所以實(shí)驗(yàn)室中的所有儀器的使用都應(yīng)在老師的指導(dǎo)下進(jìn)行，或者閱讀本儀器的使用說(shuō)明書后，方可使用。

二、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需要的儀器設(shè)備

1．滅菌

在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，許多溶液、玻璃器皿和微量移液器槍頭都要高壓滅菌，特別是在做RNA有關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，更需要干熱及濕熱高壓滅菌，以去除RNA酶，電熱干燥箱主要用于干熱滅菌；而高壓滅菌鍋主要用于高壓濕熱滅菌。

2．離心機(jī)

 幾乎每個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都要用到離心機(jī)，一個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室至少需要4臺(tái)離心機(jī)，分別為一臺(tái)低速（20000r/min）冷凍離心機(jī)、一臺(tái)超速（20000-80000r/min）離心機(jī)、一臺(tái)可離心1.5mL微量離心管的微型（MINI）離心機(jī)、一臺(tái)大容量、低速度的離心機(jī)用來(lái)收獲大量的細(xì)菌培養(yǎng)液。

3．冷凍設(shè)備

至少需要一臺(tái)普通冰箱（4℃，-20℃），如有條件，還需要一臺(tái)-80℃冰箱。許多動(dòng)物、植物、微生物的樣本以及試劑的貯存需要在低溫或者超低溫下貯存。

制冰機(jī)也是很必要的，因?yàn)樵S多反應(yīng)是在冰上進(jìn)行的。

4．光學(xué)測(cè)量

紫外/可見分光光度計(jì)主要用來(lái)檢測(cè)DNA/RNA的濃度和純度，有條件的實(shí)驗(yàn)室用DNA/RNA計(jì)算器來(lái)代替分光光度計(jì)，使用起來(lái)更方便。

5．天平

分析天平和制備天平，天平的精度要達(dá)到千分之一或者萬(wàn)分之一。

6．計(jì)算機(jī)和打印機(jī)

    主要用來(lái)進(jìn)行RAPD等實(shí)驗(yàn)的聚類分析及其他軟件分析。

7．凝膠電泳裝置

至少有一套可滿足不同分子量大小的水平電泳槽和電泳儀，對(duì)于從事大規(guī)模測(cè)序的研究人員需要配備一套測(cè)序凝膠裝置。還應(yīng)有一套用于聚丙烯酰胺蛋白質(zhì)凝膠的垂直電泳儀及電泳槽，根據(jù)需要，配備一套用于雙向蛋白質(zhì)凝膠的特制電泳儀。

8．恒溫箱（37℃）

用于培養(yǎng)細(xì)菌

9．溫控?fù)u床

    用于培養(yǎng)液的培養(yǎng)

10．磁力攪拌器（最好帶加熱功能）

    主要用于試劑的配制

11．微波爐

    用于熔化瓊脂和瓊脂糖

12．PH計(jì)（酸度計(jì)）

    試劑配制

13．0.1 μL - 5000 μL 范圍的微量移液器

    一般都為可調(diào)移液器,可調(diào)范圍分別為0.1 μL—2.5 μL 、5 μL—10 μL、10 μL —100 μL、20 μL—200 μL 、100 μL—1000 μL、1000 μL—5000 μL

14．PCR儀（熱循環(huán)儀）

    用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)

15．組織光照培養(yǎng)箱

    用于組織培養(yǎng)

16．紫外觀測(cè)儀

    紫外觀察凝膠板

17．旋渦混合器（Vortex）

    混合微量試劑

18．水浴裝置

    至少需要兩臺(tái)水浴，DNA的提取及許多反應(yīng)都要在水浴中進(jìn)行。

19．純水儀

    分子生物學(xué)所用水均為純水，水的電阻率要達(dá)到MΩ級(jí)

20．玻璃器皿及塑料制品

    大小燒杯、燒瓶、試劑瓶、量筒、吸管、攪拌棒、研磨器、離心管（1.5mL、0.5mL）、PCR管、移液器槍頭（Tip）等

21．相應(yīng)的分子生物學(xué)試劑及試劑盒

三、一些常用精密儀器的使用方法

1．  微量移液器的使用方法

    以Eppendorf型微量移液器為例實(shí)物講解

2．  冷凍離心機(jī)的使用方法

    以 Beckman Microfuge R型冷凍離心機(jī)為例實(shí)物講解

3．  PCR儀的使用方法

    以PE9700型PCR儀為例實(shí)物講解

4．純水儀的使用方法

以MiLLi-Q型純水儀為例實(shí)物講解

四、思考題

1． 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中要注意的安全事項(xiàng)有哪些？

2． 微量移液器的正確使用方法。

實(shí)驗(yàn)一  植物基因組DNA的分離

一、相關(guān)知識(shí)

分離植物DNA是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)基本要求。不同的研究目的對(duì)DNA的純度和量的要求不盡相同。例如，在構(gòu)建用于篩選植物基因或其他諸如RFLP這樣的遺傳標(biāo)記基因組DNA文庫(kù)時(shí)，需要使用高相對(duì)分子質(zhì)量、高純度的DNA；而在進(jìn)行遺傳分析時(shí)，對(duì)DNA的純度要求就可以低一些。

一般而言，一個(gè)好的DNA分離程序應(yīng)符合以下三個(gè)主要標(biāo)準(zhǔn)：（1）所得DNA的純度應(yīng)滿足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其純度的要求為可用限制性內(nèi)切酶完全酶解并可成功地轉(zhuǎn)移到膜上進(jìn)行Southern雜交；用于PCR分析的DNA則不應(yīng)含干擾PCR反應(yīng)的污染物；（2）所得DNA應(yīng)當(dāng)完整，電泳檢查時(shí)可給出精確性高、重復(fù)性好的遷移帶型；（3）所得的DNA應(yīng)有足夠的量。

如果對(duì)植物進(jìn)行大規(guī)模篩選，還應(yīng)當(dāng)滿足操作程序應(yīng)當(dāng)快速、簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，并盡可能避免使用有毒試劑這樣的要求。

二、實(shí)驗(yàn)原理

植物DNA的提取程序應(yīng)包括以下幾項(xiàng)：首先，必須粉碎（或消化）細(xì)胞壁以釋放出細(xì)胞內(nèi)溶物。分離總基因組DNA常用的破壁方法是將植物組織脹水，然后研磨成細(xì)粉；或者將新鮮植物組織在干冰或液氮中快速冷凍后，用研缽將其磨成粉沫。

其次，必須破壞細(xì)胞膜使DNA釋放到提取緩沖液中，這一步驟通?？恐T如SDS或CTAB一類的去污劑來(lái)完成。去污劑還可以保護(hù)DNA免受內(nèi)源核酸酶的降解。通常提取緩沖液中還包含EDTA，它可以螯合大多數(shù)核酸酶所需的輔助因子——鎂離子。

最后，一旦DNA釋放出來(lái)，其剪切破壞的程度必須要降到最低。劇烈振蕩或Tip頭小孔快速抽吸都會(huì)打斷溶液中高相對(duì)分子質(zhì)量的DNA。

分離高相對(duì)分子質(zhì)量的DNA還只是工作的一部分。因?yàn)樵诖痔嵛镏型写罅?/span>RNA、蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)有時(shí)很難從DNA中除去。大多數(shù)蛋白可通過(guò)氯仿或苯酚處理后變性、沉淀除去，絕大部分RNA則可通過(guò)經(jīng)處理過(guò)的RNase除去。但多糖類雜質(zhì)一般較難去除，這些雜質(zhì)濃度高時(shí)，往往用一些DNA純化試劑盒來(lái)進(jìn)一步純化DNA。

三、實(shí)驗(yàn)方法

    1．向10 mL離心管中加入5 mL的2×CTAB（十六烷基三乙基溴化銨），60℃保存預(yù)熱，預(yù)熱后加入10 μL 0.2%的巰基乙醇, 巰基乙醇的作用為抗氧化劑。

2．用液氮將研棒、研缽預(yù)冷，將0.5-1.5 g葉片放入研缽，搗碎成粉末，轉(zhuǎn)移到①中的離心管中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，使植物組織在提取緩沖中均勻分離,置于60℃水浴搖床中保溫30min。

3．加入等量5 mL氯仿，于空氣搖床中搖15min，使管內(nèi)混合物成乳濁液，此時(shí)蛋白質(zhì)充分接觸氯仿與核酸分開，室溫4000rpm離心15min分相，含蛋白質(zhì)胞碎片的有機(jī)相位于管的下面，上層為含核酸的水相。

4．離心后，用去頭的Tip（怕破壞DNA長(zhǎng)鏈）將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，將2/3量即3.3  mL預(yù)冷的異丙醇與之緩慢混勻，20℃，8000rpm離心10mim，沉淀DNA。

5．移去上清液，干燥后（用無(wú)菌操作臺(tái)通風(fēng)干燥）加1 mL TE溶解沉淀。

6．加入5 μL RNase（10mg/mL）37℃保溫45min，以去除DNA中的RNA。

7．加入等量（1 mL）苯酚—氯仿—異戊醇（25:24:1）,室溫空氣搖床緩緩混勻10 min,室溫下4000rpm離心10min，進(jìn)一步去除蛋白質(zhì),用去頭的200 μL Tip將上清轉(zhuǎn)移到一支新的離心管中。

8．加入1/2量（0.5 mL）苯酚—氯仿—異戊醇（25:24:1）,搖床緩慢混勻10min，4000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

9．加入等量（0.8-1 mL）氯仿，搖床搖勻10min，4000rpm離心10min，將上清液移到新管中,這一步可除去水相中殘留的酚。

10．加入1/10量（0.1 mL）3M NaAc，2.5倍量（2.5mL）冷乙醇，緩慢混勻，DNA沉淀析出，4000rpm離心10min。

11．棄去上清，干燥30-60min，加入0.5-1mL TE ，4℃溶解并保存。

四、實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

       1．CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)析出沉淀，因此在將其加入冷凍的植物材料中之前必須預(yù)熱。

2．在最適條件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纖維狀，很容易一下子就從溶液中鉤出。不過(guò)，某些植物種的DNA沉淀中可能含有雜質(zhì)，特別是多糖，使DNA沉淀呈絮狀或膠狀，這種情況下可能需要稍事離心才能得到DNA-—CTAB沉淀。

3．飽和酚雖然可有效地使蛋白質(zhì)變性,但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用苯酚和氯仿的混合液，可減輕這兩種現(xiàn)象，同時(shí)可加入適量的異戊醇（苯酚—氯仿—異戊醇=25:24:1），異戊醇的作用是消泡，并使蛋白質(zhì)層緊密，使水相和有機(jī)相分層較好。

五、所需儀器、耗材

1．1.5mL離心管

2．60℃水浴，37℃水浴

3．研缽、研棒

4．空氣搖床

5．冷凍離心機(jī)

6．超凈工作臺(tái)

7．冰箱

8．去頭的10 μL Tip

9．去頭的200 μL Tip

10．吸水紙

11．液氮罐

六、所需試劑

1．CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）

2．巰基乙醇

3．液氮

4．氯仿

5．冷異丙醇

6．TE緩沖液

7．RNase

8．苯酚—氯仿—異戊醇（25:24:1）

9．3M NaAC

10．冷乙醇

七、試劑配制

1．1M   Tris—HCl，pH=8.0

      Tris—HCl:121.1g        60.55g

      濃 HCl          :42mL         21mL

      加H₂O至  : 1L               500mL

      →高壓滅菌15min

2．0.5M EDTA Na₂·2H₂O，pH=8.0

      EDTA Na₂·2H₂O    :186.1g          93.05g           55.83g

      加H₂O水至   : 1L                    500mL           300mL

用NaOH調(diào)pH=8.0（約需20g NaOH顆粒）

→高壓滅菌

3．2×CTAB

40.9g NaCl；10gCTAB，50mL 1MTris-HCl（pH=8.0）

20mL 0.5M EDTA（pH8.0）定容至500mL，高壓滅菌。

4．TE緩沖液

1M Tris-HCl 5mL+ 0.5M EDTA 1mL→加水定容至500mL，高壓滅菌。

5．3M NaAC（pH=5.2）

在200mL水中溶解102g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容至250mL，高壓滅菌。

6．0.2% 巰基乙醇

100mL水中加入0.2mL巰基乙醇。

7．20×SSC

NaCl              :175.3g                 87.65g

檸檬酸鈉       :88.2g                   44.1g

10N NaOH     :數(shù)滴調(diào)pH=7.0

ddH₂O           :1L                500mL

8．10mg/mL  RNase A

取10mg RNaseA溶于1mL 2×SSC（0.1mL 20×SSC定容至1mL）中，沸水煮10分鐘，冷卻，分裝-20℃保存。

八、思考題

1．提取緩沖液中CTAB或EDTA的作用是什么？

2．怎樣去除DNA雜質(zhì)中的蛋白質(zhì)和RNA？

3．純化DNA步驟中，苯酚、氯仿、異戊醇各有什么作用？為何交替使用？

實(shí)驗(yàn)二    RNA的分離

一、RNA和無(wú)RNA酶的環(huán)境

在植物細(xì)胞中存在不同類型的RNA。rRNA占總RNA的70%;tRNA在細(xì)胞中的含量也較豐富（15%），mRNA含量為細(xì)胞總RNA的1-5%,大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3'端均有一多聚A(Poly A)尾巴。

在進(jìn)行RNA操作時(shí)，需要特別注意RNA被RNA酶降解。由于RNA酶存在于所有的生物中，并且RNA酶是一種耐受性很強(qiáng)的酶，傳統(tǒng)的高溫滅菌的方法不能使之失活。RNA酶的污染既可能源自內(nèi)部，在植物的某些組織如根中RNA酶含量特別高，也可能源自外部，如玻璃器皿，緩沖液和操作者的皮膚。其中人的皮膚表面有大量的RNA酶。所以應(yīng)盡可能在無(wú)RNA酶的環(huán)境下進(jìn)行有關(guān)RNA操作,具體措施如下：

1．分離RNA以前，將所用玻璃制品及取樣剪刀、鑷子等置于烤箱在300℃下燒烤4h或180℃烘烤8h以滅菌。

2．應(yīng)用焦碳酸二乙酯處理過(guò)的水（DEPC-SDW）進(jìn)行溶液的配制，并高壓滅菌20min。DEPC是RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑。DEPC-SDW配制如下：

100mL水中加入0.2mL DEPC原液，放于搖床上充分混勻并在室溫下作用數(shù)小時(shí)，然后高壓滅菌15min。

3．所用的Tip、離心管、PCR管等塑料制品都用0.05% DEPC-H₂O處理：灌滿DEPC-H₂O，37℃放置2小時(shí)，用DEPC-SDW沖洗 ，并于100℃干烤15分鐘并高壓滅菌15分鐘。

4．人的汗液中含有RNA酶，故在所有步驟中均應(yīng)戴手套并經(jīng)常更換，通常使用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備諸如移液吸管等應(yīng)浸泡于酒精中，使用前晾干。

二、實(shí)驗(yàn)原理

總RNA提取采用一步法進(jìn)行（TRIzoL試劑），試劑中有酚、胍和硫代氰酸鹽，是由Chomczyanski和Sacchi發(fā)展的一種改進(jìn)的提取RNA的方法。在進(jìn)行樣品均質(zhì)化和溶解過(guò)程中，TRIzoL試劑可以可以破碎細(xì)胞，破壞核蛋白復(fù)合體，使RNA順利地解脫出來(lái)溶進(jìn)緩沖液，同時(shí)TRIzol試劑可以保持RNA的完整性。由于RNA在堿性條件下不穩(wěn)定，因而在整個(gè)提取RNA過(guò)程中體系始終保持酸性至中性，而在酸性條件下DNA極少發(fā)生解離，DNA同蛋白質(zhì)一起變性后被離心下來(lái)，這時(shí)溶液分為液體相和組織相，RNA可以完整地保存在液體相中。在提取液體相后，加入異丙醇來(lái)沉淀RNA，最后用75%乙醇來(lái)洗RNA。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）均質(zhì)化及分相

1．玻璃研磨器中放1mL TRIzol RNA提取液

2．冰上研磨

3．研磨液移入1.5mL離心管，室溫放置5分鐘。

4．加入0.2mL氯仿，蓋好蓋，用手（或vortex）劇烈振動(dòng)15秒。

5．再在室溫下放置2-3分鐘。

6．4℃條件下12000g離心15min，離心管中共分三相，上層為RNA液體相，中層為DNA及碎破組織相，下層為酚-氯仿相。

7．上清液RNA液體相移入新的離心管中。

（二）RNA沉淀

       8．與0.5mL的異丙醇混勻后，室溫放置10分鐘（洗氯仿，沉淀RNA）。

       9．4℃離心12000g 10分鐘。

（三）洗滌

       10．倒掉上清液后加入1mL的75%乙醇振蕩（vortex）洗RNA（洗掉異丙醇）。

       11．4℃條件下7500g離心5分鐘。

（四）重溶RNA

       12．去掉乙醇。

       13．干燥10分鐘。

       14．用DEPC-SDW 50 μL溶解RNA沉淀，可在55-60℃條件下溫育10min。

       15．加入3倍體積的無(wú)水乙醇（150 μL）放入-20℃或-80℃下保存。

四、所需儀器、耗材

1．180℃烘箱

2．4℃離心機(jī)

3．玻璃研磨器

4．離心管

5．移液器

6．槍頭

7．飯盒

8．濾紙

9．玻璃器皿

10．高壓滅菌鍋

11．沙布

12．一次性手套

13．水浴

14．vortex

15．白瓷盤

五、所需試劑

1．TRIzol試劑

2．氯仿

3．異丙醇

4．75%乙醇（用DEPC-SDW配制）

5．DEPC-H₂O

六、思考題

1．  TrizoL試劑在實(shí)驗(yàn)中的作用是什么？

2．  實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，加入氯仿后，溶液共分為哪三相？

3．  怎樣達(dá)到盡可能的無(wú)RNA酶的環(huán)境？

實(shí)驗(yàn)三  DNA/RNA的瓊脂糖凝膠檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)原理

       分離出細(xì)胞的總RNA或部分RNA之后，根據(jù)它們相應(yīng)的遷移可以通過(guò)電泳分辨RNA分子，是檢測(cè)RNA分子是否降解的關(guān)鍵一步。

       電泳是現(xiàn)在用于分離和純化DNA/RNA片段的最常用技術(shù)。當(dāng)制備好的一塊“膠”即一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)并把它置于靜電場(chǎng)中，DNA/RNA分子將向陽(yáng)極移動(dòng)，這是因?yàn)?/span>DNA/RNA分子沿其雙螺旋骨架兩側(cè)帶有富含負(fù)電荷的磷酸根殘基。當(dāng)DNA/RNA長(zhǎng)度增加時(shí)，來(lái)自電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)力和來(lái)自凝膠的阻力之間的比率就會(huì)降低，不同長(zhǎng)度的DNA/RNA片段就會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。因而就可依據(jù)DNA/RNA分子的大小使其分離。

       依據(jù)制備凝膠的材料，凝膠電泳可分成兩個(gè)亞類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA/RNA（5—500bp）****，其分辨力極高，相差1bp的DNA片段就能分開，其不足之處為制備和操作較為困難。瓊脂糖凝膠的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝膠低，但其分離范圍較廣。用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長(zhǎng)度為200bp至近50kb的DNA/RNA片段。

（一）瓊脂糖凝膠

       1．瓊脂糖濃度

       采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子。

2．EB染料的存在

       溴化乙錠（EB）是一種吖啶類染料，它在紫外燈照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射下檢測(cè)瓊脂糖中的DNA。

含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍

3．電泳緩沖液的組成

       有幾種不同的緩沖液可用于電泳，分別為 Tris—乙酸（TAE）、Tris—硼酸（TBE）或Tris—磷酸（TPE），其濃度約為50mmoL/L，PH為7.5—7.8,這些緩沖液均含有EDTA。這些緩沖液通常配制成濃縮液，貯存于室溫。

常用的電泳緩沖液的配制

4．加樣緩沖液：

       加樣緩沖液可以增大樣品密度，以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)，還可以使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利，溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約為二甲苯青FF的2.2倍, 溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率約與長(zhǎng)300bp的雙鏈線性DNA相同,而二甲苯青FF在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速率則與4kb雙鏈線性DNA相同。選用哪一種加樣緩沖液純屬個(gè)人喜惡。

5．DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記

DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記通常叫作 DNA Marker,本實(shí)驗(yàn)使用Gene Ruler^TM  DNA Ladder Mix 為DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)記，分別由100bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1031 bp、1200 bp、1500 bp、2000 bp、2500 bp、3000 bp、3500 bp、4000 bp、5000 bp、6000 bp、8000 bp、10000 bp 組成，DNA Marker不僅可以作為凝膠中DNA片段長(zhǎng)度的一個(gè)標(biāo)記，還可以作為電泳的對(duì)照。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．50×TAE的稀釋：如制備50mL 1×TAE，取1mL 50×TAE加入49mL水定容至50mL。

2．制備1%的瓊脂糖膠液：取0.2g瓊脂糖溶于20mL TAE中，在短時(shí)間里加熱瓊脂糖全部熔化，使溶液冷卻至60℃，加入濃度為10mg/mL的EB 2μL，使EB的終濃度為1μg/mL。

3．用于RNA電泳的電泳槽用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥后灌滿3% 的H₂O₂溶液，于室溫放置10分鐘，然后用DEPC—SDW沖洗電泳槽，梳子同樣處理。

4．用膠帶封住膠床，放好梳子。

5．將溫?zé)岘傊堑谷肽z床中，凝膠的厚度在3—5mm之間，凝固20—60min。

6．在凝膠完全凝固之后，小心移去梳子和膠帶，將膠床放在電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑極）。

7．向電泳槽中注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高于膠面1cm。

8．分別將RNA樣品與加樣緩沖液混合，（10μL RNA樣品+2μL 6×加樣緩沖液），用移液槍將12μL樣品加入加樣孔。

9．正確連接電泳槽和電源，設(shè)定穩(wěn)壓為75V，電流一般為50mA。

10．電泳結(jié)束后，在紫外觀測(cè)儀上進(jìn)行觀察，可以看到提取完整的RNA共有三條帶，分別是5kb的28S rRNA, 2kb 18S rRNA及0.1—0.3kb的5S rRNA及tRNA，可以看到28S rRNA的含量約為18S rRNA含量的2倍，說(shuō)明總RNA完整性良好，無(wú)降解。

三、注意事項(xiàng)

溴化乙錠溶液的凈化處理：

   溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，有中度毒性，可致癌，使用這一染料時(shí)務(wù)必戴上手套。

       1．溴化乙錠濃溶液（濃度＞0.5mg/mL）的凈化處理。

       ①加入足量的水使EB的濃度降低至0.5mg/mL以下。

②加入1倍體積的0.5moL/L KMnO₄，小心混勻后再加1倍體積的2.5moL/L HCL，小心混勻，于室溫放置數(shù)小時(shí)。

③加入1倍體積的2.5moL/L NaOH，小心混勻后可丟棄該溶液。

2．溴化乙錠稀溶液（如含0.5μg-1μg/mL溴化乙錠的電泳緩沖液）的凈化處理。

①每100mL溶液中加入100mg粉狀活性炭。

②于室溫放置1小時(shí)，不時(shí)搖動(dòng)。

③用濾紙過(guò)濾溶液，丟棄濾液。

④用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害物予以丟棄。

四、所需儀器、耗材

       1．電泳儀                          6．微量移液器

       2．電泳槽                          7．紫外觀測(cè)儀或紫外燈

       3．天平                           8．各種玻璃器皿

       4．磁力攪拌器                     （燒杯、容量瓶及廣口瓶各種規(guī)格）

       5．酸度計(jì)                          9．紫外防護(hù)鏡

五、所需試劑

1．  EDTA—Na₂·2H₂O  （乙二胺四乙酸二鈉鹽）

2．  溴化乙錠（EB）

3．  瓊脂糖

4．  Tris   （三羥基氨基甲烷）

5．  冰醋酸

6．  溴酚藍(lán)

7．  蔗糖或甘油

8．  二甲苯青FF

六、試劑配制

1．加樣緩沖液：（6×）IV型

          0.25%溴酚藍(lán)，40%（W/V）蔗糖水溶液

          如配50mL，加入0.125g溴酚藍(lán)，20g蔗糖，混勻，定容至50mL，4℃保存。

2．TAE，50×濃縮貯存液：

   Tris 242g，冰醋酸57.1mL，100mL 0.5moL/L EDTA, PH=8.0，加600mL水劇烈攪拌，定容至1000mL。

3．0.5moL/L  EDTA， PH=8.0

   在800mL水中加入186.1g EDTA—Na₂·2H₂O，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的PH值至8.0（EDTA—Na₂·2H₂O在溶液PH值接近8.0時(shí)，才能完全溶解），然后定容至1 L，分裝后高壓滅菌備用。

4．溴化乙錠貯存液（10mg/mL）：

   在100mL水中加入1g溴化乙錠，用磁力攪拌器攪拌幾個(gè)小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，4℃貯存。

七、思考題

1．  加樣緩沖液的作用是什么？

2．  瓊脂糖中加入EB的作用是什么？

3．  電泳時(shí)，為什么DNA/RNA分子將向陽(yáng)極移動(dòng)？

實(shí)驗(yàn)四  DNA/RNA濃度、純度的測(cè)定及濃度的調(diào)整

一、實(shí)驗(yàn)原理

       在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，提取DNA或RNA后，往往需要測(cè)定其純度和濃度，在純度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，濃度調(diào)整到所需濃度后，才能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

       有條件的實(shí)驗(yàn)室，利用DNA/RNA計(jì)算器，能夠很方便、很迅速地測(cè)定DNA/RNA濃度和純度，但DNA/RNA計(jì)算器往往很昂貴。一般實(shí)驗(yàn)室常利用紫外分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定DNA/RNA的濃度。

       1．對(duì)于DNA，根據(jù)其在260、280、310nm下紫外吸收值A₂₆₀、A₂₈₀、A₃₁₀，可確定其純度和濃度。

       對(duì)于dsDNA：1.0A₂₆₀=50μg/mL

     ssDNA：1.0A₂₆₀=33μg/mL

純DNA溶液的A_260/280應(yīng)為1.8±0.1，高于1.8則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。

A₃₁₀值是背景，若鹽濃度較高，A₃₁₀值也高。

2．對(duì)于RNA，根據(jù)其在230、260、280nm下紫外吸收值A₂₃₀、A₂₆₀、A₂₈₀，可確定其純度和濃度。

1.0A₂₆₀=40μg/mL

A_260/A₂₈₀應(yīng)介于1.7_~2.0之間

如果A_260/280比值太小，說(shuō)明可能RNA樣品中污染了蛋白或苯酚。A_260/A₂₃₀的比值應(yīng)該大于2.0，否則就可能被異硫氰酸胍（TRizoL試劑成分）污染了。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．測(cè)定前，石英比色杯須用濃鹽酸：甲醇=1：1溶液浸泡1小時(shí)，隨后用DEPC-SDW徹底沖洗。

2．以實(shí)驗(yàn)三中最終提取的RNA樣品為例。

原RNA樣品中共有200μL水，向樣品中加入2μL 3moL/L PH=5.2的乙酸鈉溶液，使其終濃度為0.03moL/L，充分混合進(jìn)行沉淀，4℃ 12000g下離心5min，去上清液，用預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀，晾干，然后用DEPC-SDW 20μL溶解RNA。

3．用DEPC-SDW對(duì)待測(cè)樣品做1：1000倍數(shù)稀釋（2μL樣品加入1.998 mL DEPC-SDW）。

4．分別測(cè)定樣品的A₂₆₀、A₂₈₀及A₂₃₀。

5．分別計(jì)算樣品A_260/A280及A_260/A230的比值。

三、所需儀器

       1．離心機(jī)

       2．微量移液槍

       3．紫外分光光度計(jì)

四、所需試劑

1．  濃鹽酸

2．  甲醇

3．  乙酸鈉

4．  DEPC-SDW

五、試劑配制

       3moL/L   乙酸鈉（PH5.2）250mL 溶液的配制：

       在200mL DEPC-SDW中溶解 102.025g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)PH值至5.2，加入25μL原溶液DEPC，然后定容至250mL，放置過(guò)夜，高壓滅菌15min。

六、思考題

1．  怎樣確定DNA或RNA溶液的濃度？

2．  根據(jù)你所測(cè)得的DNA或RNA的濃度，試計(jì)算如果把溶液濃度調(diào)節(jié)到0．1μg/μL應(yīng)向溶液中加入多少μL的水？