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實驗五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
一、實驗原理
體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中才能大量的進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細(xì)胞會易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前實驗室常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)菌處于0°C 、CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細(xì)胞膜表面，經(jīng)42°C短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。宿主細(xì)胞一般是限制―修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，而質(zhì)粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個克隆含有質(zhì)粒。
本實驗以E.coli JM109菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未有轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及DNA測序等實驗。
二、儀器及試劑
1. 儀器：
恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、分光光度計、高速冷凍離心機、臺式離心機。
2. 材料
E.coli JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。
3. 試劑：
LB培養(yǎng)液（1L）：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g（高鹽）或5g（低鹽）
氨芐青霉素（Ampicillin） 100mg/ml
在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃備用。
LB平板培養(yǎng)基：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g或5g ，
瓊脂 13g
在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至50℃，取出培養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需30～50ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)基完全凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4℃備用。
其它試劑： 0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水
三、操作步驟
1. 感受態(tài)細(xì)菌的制備：
（1）用接種環(huán)從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，接種于裝有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜（12～16h）。
（2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養(yǎng)基三角瓶中中，37℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)2－3h，隔20－30min測量OD600值，至OD600值為0.3-0.4。無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。
（3） 4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細(xì)菌。
（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。每管加1ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴30 min 。
（5）4℃，12000 rpm，2 min。
（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加100 ul冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2重新懸浮細(xì)胞（重懸時操作要輕），即成感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。
2.細(xì)菌轉(zhuǎn)化：
（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號1、2、3、分別加入以下各組分：加入10～20ng質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時做兩個對照組：
1號：受體菌對照組： 100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul無菌ddH2O
2號：質(zhì)粒DNA對照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19
3號：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul pUC19
（2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進(jìn)DNA分子在感受態(tài)細(xì)胞表面的吸附。
（3）轉(zhuǎn)入42℃水浴2min，通過熱刺激增強CaCL2的作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生通道，便于DNA分子的吸附進(jìn)入，提高轉(zhuǎn)化率。
（4）迅速轉(zhuǎn)入冰上冷卻2min，修復(fù)細(xì)胞膜。
（5）加600u無抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃，220 rpm，振蕩60min。使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并且表達(dá)Ampicillin抗性基因。
（6）取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺直至液體被吸收，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12－16h后觀察結(jié)果，其余保存于4℃。如果平板上沒有長出菌落，可將之置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，同時將剩下的500ul菌液離心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含Ampicillin的LB平板上，置37℃培養(yǎng)。
（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計算轉(zhuǎn)化率。
四、注意事項：
1. 實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源DNA的污染。
2. 實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無菌超凈工作臺上進(jìn)行。
3. 必須設(shè)對照組，以檢驗實驗過程中是否有污染。
4. 整個實驗過程均需置于冰上。
5. 選用對數(shù)生長期細(xì)胞，OD600不應(yīng)高于0.6。
實驗六 動物組織細(xì)胞基因組 DNA提取
一、實驗原理
真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細(xì)胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可將 蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。
二、儀器及試劑
1. 儀器：
恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）
2. 試劑：
（1）細(xì)胞裂解緩沖液：
Tris (pH8.0) 100 mmol/L
EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L
NaCL 20 mmol/L
SDS 10%
胰RNA酶 20ug/ml
（2） 蛋白酶K： 稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃備用。
（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。
（4）酚?氯仿?異戊醇（25:24:1）、
（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。
三、操作步驟
1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
2.加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）
3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。
四、常見問題
1.選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。
2.在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少DNA團(tuán)塊形成。
3. 提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。
4. 電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入SDS至終濃度為0.5%，并重復(fù)步驟2～8。
6.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊?/span>DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。
實驗七 DNA的定量
一、 實驗原理
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。
1 OD260相當(dāng)于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml?？梢源藖碛嬎愫怂針悠返臐舛取?/span>
紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為2.0, 若DNA高于1.8,則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。
對于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進(jìn)行測定。DNA 本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對平面之間并與之結(jié)合后，DNA樣品能在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔紅色熒光。熒光強度與被結(jié)合的EB的量成正比，而被結(jié)合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對照，可比較出被測DNA溶液的濃度。靈敏度可達(dá)1～5ng。由于是基于目測，所以是估計水平。 該方法經(jīng)濟(jì)簡便，但準(zhǔn)確性較低。
二、儀器及試劑
1. 儀器：Amersham GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備。
2. 試劑及配制：
5×上樣緩沖液：
配制10 ml
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2 ml
10% SDS 50 ul
50% 甘油 2.5 ml
0.2% 溴酚藍(lán) 10 mg
0.2% 二甲苯青FF 10 mg
加去離子水至10 ml
其它試劑：0.1×TE 、DNA標(biāo)準(zhǔn)液，EB儲存液（10 mg/ml），
三、實驗步驟
1.紫外分光光度法
（1）用0.1×TE對待測DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。
（2）開機，儀器會自動對光路及分析軟件進(jìn)行檢測，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時，進(jìn)入核酸測定窗口
（3）調(diào)零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點擊“set ref”鍵，儀器自動校正零點。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測樣品。
（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5～7ul的石英樣品杯。點擊“enter” 鍵，儀器即進(jìn)入分析狀態(tài)。窗口同時顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。
（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風(fēng)干后，再加入下一個待測樣品。
（6）DNA純度：以OD260/ OD280比值來反映。當(dāng)OD60 /OD80比值 <1.8時，說明樣品存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)，可采用平衡酚/氯仿―異戊醇再抽提除去蛋白質(zhì)或用乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE懸浮后再測定。當(dāng)OD60/OD280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。
2. EB熒光分析法
（1）瓊脂糖凝膠的制備。
（2）樣品的準(zhǔn)備。把待測DNA樣品進(jìn)行1:2連續(xù)稀釋，并準(zhǔn)備一份DNA標(biāo)準(zhǔn)液作對照。
（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。
（4）電泳。用100V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。
（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴(yán)重污染干擾核酸紫外線吸收物質(zhì)的情況。
四、常見問題
1． 紫外分光光度法不能區(qū)分DNA分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體DNA和RNA等。由于測定吸收光度A260時，難以排除RNA、染色體DNA、以及DNA解鏈的增色效應(yīng)等因素的影響，因此測得的數(shù)據(jù)往往比實際濃度偏高。
2．OD320值是背景，若溶液鹽濃度越高，OD320也越高。
3．測樣品時使用的石英樣品杯比較貴，要小心不要摔破，持杯時也不要接觸透明的光面以避免干擾測定。
實驗八 PCR基因擴(kuò)增
一、實驗原理
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將在待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)互補的兩個寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴(kuò)增 2n 倍。該技術(shù)已成為分子生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個在模板DNA、一對已知序列的寡核苷酸引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。整個擴(kuò)增過程分三步：①變性，加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板DNA引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、結(jié)構(gòu)簡單等特點，主要的結(jié)合發(fā)生在引物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的 3 ′端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新的DNA鏈。完成以上三步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)過25～40個循環(huán)后，DNA 可擴(kuò)增106～109倍。 現(xiàn)用圖示說明PCR原理:
二、儀器及試劑
1.儀器：PCR儀、臺式離心機、移液器及吸頭、PCR薄壁管、電泳儀等
2.試劑：
10X PCR 緩沖液配制（部分隨Taq酶提供）：
250～500 mmol/L KCl
100～500 mmol/L Tris-Cl（pH8.4）
15～20 mmol/L MgCl2
0.5% Tween-20
1mg/L BSA
其它試劑：模板DNA、dNTP 混合液、Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖凝膠、等
三、操作步驟
1. PCR 體系（40ul）：
4ul 10XPCR 緩沖液
4ul 25mM MgCl2（根據(jù)不同公司PCR 緩沖液的不同而定）
Xul 模板DNA ≥50ng
1ul 上游引物（50-100ng）
1ul 下游引物（50-100ng）
1ul dNTP Mixture（終濃度20－200uM）
0.4 ul Taq聚合酶
加ddH2O至40ul
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2. 將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6000 rpm離心15 sec使反應(yīng)成分集于管底。
3. PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置：
（1） 95℃ 300s 變性
（2） 94℃ 45s 變性
（3） 55℃ 45s 退火（根據(jù)不同引物可能有不同退火溫度）
（4） 72℃ 45s 延伸（每分鐘可延伸1kp）
重復(fù)步驟2-4共 30 循環(huán)
（5） 72℃ 600s 延伸
反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，吸取少量（10ul）進(jìn)行分析，其余置
4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
4. 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。
四、 注意事項：
1. PCR 體系所加成分的實際用量應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進(jìn)行核算。
2.加樣時要認(rèn)真,吸頭垂直進(jìn)入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。
3.Taq聚合酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。
五 、影響PCR的主要因素
1.模板DNA
單鏈、雙鏈DNA均可作為PCR的模板，DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。模板用量依具體實驗而定，一般為100ul反應(yīng)液有105-106個目標(biāo)分子。PCR反應(yīng)時模板變性要充分。
2. PCR引物
PCR引物設(shè)計是否成功是能否獲得高質(zhì)量PCR產(chǎn)物最關(guān)鍵的因素之一。在設(shè)計和應(yīng)用時，需注意以下重要環(huán)節(jié)：
（1）PCR引物的長度約為18～30個核苷酸，并且成對引物間的G＋C含量應(yīng)相似。以使它們在相近的溫度下與其互補序列結(jié)合。G+C含量應(yīng)為45%～55%之間。堿基分布是隨機的，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，尤其是不應(yīng)在其3，端出現(xiàn)3個連續(xù)G或C，否則會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避免選用T ,尤其應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)2個以上T。
（2）一般來說，PCR產(chǎn)物≤500bp時，引物長度選擇16-18bp；PCR產(chǎn)物≥5kb時，引物長度選擇24bp左右為宜。
（3）要避免引物分子自身序列互補，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。兩個PCR引物相互之間的3，末端序列不能有明顯的互補性，以免形成引物二聚體。
（4）引物的熔點溫度（Tm值）要適當(dāng)。Tm值與引物的堿基組成和長度有關(guān)；PCR引物的GC/AT應(yīng)與要擴(kuò)增的模板DNA相當(dāng)或略高些。一般熔點溫度以大于55℃為宜。
（5）引物的3，末端必須與模板嚴(yán)格互補，而5，末端的要求可靈活些。
（6）目前在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計算機軟件，從EMBL或Genebank中查找有關(guān)基因序列，并對設(shè)計的引物在引物二聚體形成、自身互補性及特異性等方面進(jìn)行分析評價。
（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內(nèi)切酶位點。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，一般在酶切位點的5，端再加上幾個額外的堿基。
（8）引物的濃度，在終濃度為0.2～1.0 umol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同，低于0.2 umol/L時會影響產(chǎn)量。但過高時一乃不經(jīng)濟(jì)，二則會出現(xiàn)非特異擴(kuò)增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。
3. 熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）
一般用量為2.5 U/100uL 反應(yīng)體積。酶量過多易導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。該類酶的最適溫度為75℃，在低溫下仍保留相當(dāng)高的活性，易引起不完全配對的引物-模板的非特異延伸及引物二聚體的擴(kuò)增延伸，所以應(yīng)注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。
4. dNTPs
PCR常用的dNTP濃度在50-200umol/L。四種dNTPs應(yīng)等當(dāng)量。濃度
低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實驗來確定最適的dNTP濃度。
5. PCR緩沖液
因PCR反應(yīng)中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應(yīng)液中游離Mg2+的濃度，所以應(yīng)按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)中（dNTP濃度200umol/L），Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性。濃度高則出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，過低則酶活性顯著下降。應(yīng)用無核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對酶有一定的保護(hù)作用。
6. PCR循環(huán)的溫度
預(yù)變性：起始變性的時間應(yīng)該長些，以使變性充分。一般為94℃ 3-5min。變性不完全時，DNA雙鏈會很快復(fù)性，影響PCR反應(yīng)，但若變性溫度太高（不宜超過95℃），會影響Taq酶的活性。
變性：一般為94℃ 30s或95℃ 20s。
引物退火：應(yīng)根據(jù)具體反應(yīng)中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定。一般為50-72℃。退火溫度增高會增強對不正確退火引物的識別，還能降低引物3，端不正確核苷酸的錯誤延伸。
延伸：一般為72℃ 60-90s。最后一個循環(huán)后應(yīng)在72℃保留5min，以保證PCR產(chǎn)物合成的完整性。
7． 平臺效應(yīng)和PCR循環(huán)的次數(shù)
在PCR基因擴(kuò)增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂平臺效應(yīng)。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應(yīng)及非特異性產(chǎn)物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環(huán)次數(shù)，既能得到足夠量的PCR產(chǎn)物，又不要無意義地增加循環(huán)次數(shù)。
8. 操作環(huán)境
避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標(biāo)DNA的污染等。
實驗九 瓊脂糖凝電泳分離與純化目的DNA
一、實驗原理
分離和純化DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在電泳過程中不同大小的片段分離位于不同的位置，切下目的片段并采用低熔點瓊脂糖回收法即可獲得目的片段。有許多型號的低熔點瓊脂糖可在65℃時熔化成液體，在30℃時凝固成凝膠。由于雙鏈DNA的解鏈溫度高于65℃，所以可以熔化凝膠而DNA并不變性，在凝膠成液態(tài)時回收DNA片段。該法的優(yōu)點是可直接在熔化的凝膠中進(jìn)行各種酶反應(yīng)，如合成同位素探針、進(jìn)行限制酶切割和連接反應(yīng)等。
二、儀器及試劑：
1.儀器
電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、離心管、吸頭等。
2.試劑：
低熔點瓊脂糖、待純化的DNA、凝膠回收試劑盒、去離子水或TE（pH7.6）。
三、操作步驟：
1.配制1％的瓊脂糖凝膠，在適當(dāng)?shù)奈恢们幸粭l與加樣槽平行的槽，換低熔點瓊脂糖凝膠。
2.加樣，100V電泳，觀察所需片段是否移至低熔點膠內(nèi)。
3.在紫外燈下切含有DNA的低熔點膠，置1.5 ml離心管中，于70℃熱水中熔化。
4.按凝膠回收試劑盒說明書操作。
12.取適量純化好的目的DNA在 GeneQuant 中檢測，確定純度和濃度，其余樣品于-20℃保存。
四、 注意事項：
1. 配凝膠的三角瓶、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈
實驗十 DNA重組
一、實驗原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA叫做重組子。DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術(shù)之一，其本質(zhì)是一個酶促反應(yīng)過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段的51端磷酸和31端羥基之間相互作用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對底物的要求低，能更有效地連接DNA的平末端，應(yīng)用更廣泛。
T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分3步：①首先，ATP與T4噬菌體DNA連接酶通過ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶―ATP復(fù)合物。②被激活的AMP隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的51端的磷酸基團(tuán)上，形成磷酸―磷酸鍵。③DNA鏈31端的羥基被活化，取代ATP后與DNA51端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和ATP作為輔助因子，在一定的溫度和pH條件下進(jìn)行連接反應(yīng)。
二、儀器及試劑：
1. 儀器：
臺式離心機、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋等。
2. 試劑：
T4 DNA連接酶、10×T4 DNA連接酶緩沖液、 載體DNA、外源DNA。
三、操作步驟
1. 外源DNA片段和載體DNA的連接
取1只無菌Ep管、用微量進(jìn)樣器按下列順序加入各成分。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
酶切后的DNA片段 *1 約0.3 pmol
酶切后的載體DNA *2 約0.03pmol
T4 DNA Ligase 1ul
ddH2O 加至 25ul
*1 DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3－10倍。
*2 相同末端的載體與DNA片段進(jìn)行連接時，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。
2.蓋好蓋子，用手指輕彈Ep管數(shù)次，并于臺式離心機離心2s 以集中溶液。
3.將反應(yīng)管放入16℃過夜反應(yīng)（12～16h）。
4.取出約25ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定連接結(jié)果，以未經(jīng)連接的質(zhì)粒DNA片段和酶切DNA片段作電泳。
5.用0.1×TE將連接混合物稀釋至50ul，使用10～20ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
四、注意事項
1. 連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后應(yīng)迅速做轉(zhuǎn)化實驗。
2. 根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)酶的用量。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。
3. 單價陽離子或低濃度的聚乙二醇可提高平端連接的效率。
4. 防止載體DNA自身環(huán)化，常用堿性磷酸酶處理線性載體，去掉載體的51?C磷酸以抑制DNA片段的自身環(huán)化。
5. 正確調(diào)整載體DNA和外源DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物。
五、相關(guān)問題
1. 連接反應(yīng)的影響因素
除了載體、供體的濃度及其比例等因素外，影響連接反應(yīng)的因素還有很多，如緩沖液組分、連接溫度與時間、酶濃度、DNA濃度及片段末端的堿基序列等。
（1）連接緩沖液的影響
不同的公司提供的連接緩沖液可能有所不同，但大體上都含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應(yīng)所必需的。
（2）pH的影響
一般將緩沖液的pH調(diào)節(jié)到7.4-7.8，較多用7.8。有實驗表明，若把pH為7.5-8.0時的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時僅為全部活力的65%；當(dāng)體系偏酸（PH為6.9）時僅為全部活力的40%。
（3）ATP濃度的影響
連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，ATP的最適濃度為0.5-1mmol/L，過濃會抑制反應(yīng)。例如，5mmol/L的ATP會完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報道，當(dāng)ATP的濃度為0.1mmol/L時，去磷酸載體的自環(huán)比例最大。由于ATP極易分解，所以當(dāng)連接反應(yīng)失敗時，除了DNA與酶的問題外，還應(yīng)考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應(yīng)于-20℃保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時最好分小管貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的ATP母液。
（4）連接溫度與時間的影響
因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16℃，時間為4-16h?，F(xiàn)經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，對于一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當(dāng)好的連接效果，當(dāng)然如果時間充裕的話，20℃ 60min能使連接反應(yīng)進(jìn)行得更完全一些。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。
（5）酶濃度的影響
根據(jù)New England Biolabs公司對T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16℃ 30min內(nèi)連接20ul體系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端為0.12umol/L 5,末端，此時DNA質(zhì)量濃度約為300ng/ul）的50%。日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時酶用量要比連接黏端大10-100倍，廠商為了滿足這一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個單位/ul），所以進(jìn)行黏末端連接時需先行稀釋。除了立即用于反應(yīng)的部分可用酶反應(yīng)緩沖液稀釋外，其余都應(yīng)使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用。
（6）DNA濃度的影響
盡管有的實驗手冊上推薦使用0.1-1nmol/L的DNA濃度，但考慮到用質(zhì)粒作為載體克隆時，最后要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，所以DNA濃度不可過高，一般不會超過20nmol/L。相比較而言，以噬菌體、cosmid質(zhì)粒為載體的克隆過程最后要求線性化的連接產(chǎn)物，所以，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。此外，在用大質(zhì)粒載體進(jìn)行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連接反應(yīng)中，DNA濃度還應(yīng)降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個nmol/L。另據(jù)研究，T4 DNA連接酶對DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連接時DNA濃度不應(yīng)低于1nmol/L。即應(yīng)具有2nmol/L的末端濃度。
2. 三種連接酶單位定義
（1）Weiss單位
連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現(xiàn)也稱PPi單位。他的單位定義為：37℃ 20min內(nèi)將1nmol的32P從焦磷酸根上置換到ATP分子上所需的酶量?，F(xiàn)在大多數(shù)廠商仍使用這種單位。
（2）d（A-T）環(huán)化單位
由于Weiss單位定義中測試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷交換功能，并且測試溫度高達(dá)30℃，與實際連接反應(yīng)相比無論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d(A-T)環(huán)化單位，又稱外切酶抗性檢測。d（A-T）環(huán)化單位的定義為：30℃ 30min 內(nèi)將100nmol/L的d（A-T）（約2kb長）轉(zhuǎn)化成抗外切酶的形式。
（3）黏性末端單位
與Weiss單位相比，d（A-T）環(huán)化單位更接近實際，但仍有一定的問題，例如，環(huán)化單位測試中用的是純AT片段，與實際連接中4種堿基隨機排列不符；再說，如果連接酶將片段連接成多聚體而末環(huán)化時，仍可能被外切酶組所切；除此之外，與實際上大多數(shù)連接反應(yīng)使用的溫度16℃相比，30℃仍顯得偏高。為了衡量實際連接條件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最實用的黏性末端單位，它的單位定義為：16℃ 30min內(nèi)將5,末端濃度為0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%連接上。
實驗十一 動物組織細(xì)胞總RNA的提取
一、實驗原理
RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA 是很多分子生物學(xué)實驗所必需的，如Northern雜交、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。由于細(xì)胞內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復(fù)合體的形式存在，所以在提取RNA時要利用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑，迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。再通過酚、氯仿等有機溶劑處理、離心，使RNA與其他細(xì)胞組分分離，得到純化的總RNA。在提取的過程中要抑制內(nèi)源和外源的RNase活性，保護(hù)RNA分子不被降解。因此提取必須在無RNase的環(huán)境中進(jìn)行?？墒褂?/span>RNase抑制劑，如DEPC是RNase的強抑制劑，常用來抑制外源RNase活性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。
本實驗介紹異硫氰酸胍法和TRIzol法提取動物組織總RNA并通過電泳 進(jìn)行鑒定。
二、儀器和試劑
1.儀器：
超凈工作臺、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、凝膠成像系統(tǒng)、振蕩器、移液器、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、
玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應(yīng)用0.1% DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。
2.試劑：
(1)細(xì)胞裂解液：
異硫氰酸胍 4mol/L
檸檬酸鈉（pH7.0） 25mmol/L
十二烷基肌氨酸鈉 0.5%
β-巰基乙醇 0.1mol/L
稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
(2)10×凝膠緩沖液：
嗎啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0） 200mmol/L
NaAc 100mmol/L
EDTA(pH 8.0) 10mmol/L
過濾除菌后避光保存。
（3）5×變性上樣緩沖液：
水飽和的溴酚藍(lán) 16μl
500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80μl
甲醛（37%） 720μl
甘油 2ml
甲酰胺 3084μl
10×凝膠緩沖液 4ml
加無RNase水至10ml，4℃可保存3個月。
（4）TRIzol RNA抽提試劑
（5）2mol醋酸鈉
（6）0.1% DEPC
(7)平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）
（8）平衡酚、氯仿
（9）無水乙醇、70%乙醇、異丙醇
(10)無RNase水
三、操作步驟
（一）異硫氰酸胍法（PLT）
1.取新鮮動物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液1ml,在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一試管中。
2.加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。
3.加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。
4.將混合物轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep管中，4℃，離心10 000r/min,20min.
5.移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置?C20℃，30min沉淀RNA.
6. 4℃，離心12 000r/min，15min.
7. 棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被懸浮，則4℃離心10 000r/min，10min。
8. 棄上清液，自然干燥，但應(yīng)避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。
9.加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），?C70℃保存。
（二）TRIzol試劑提取RNA
1.取新鮮動物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的Trizol液 1ml 于玻璃勻漿器中，在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室溫下靜置5min。
2.加入200μl氯仿，劇烈振搖15s混勻后，室溫靜置3min。
3. 4℃，10 000r/min離心15min，RNA分布于水相中。
4.將上層無色水相轉(zhuǎn)移到另一Ep管中，加入500μl 異丙醇，室溫靜置10min。
5.4℃，10 000r/min離心10min。
6.棄上清液，用1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，4℃，7500r/min離心5min。
7.棄上清液，室溫干燥15min.
8.向干燥過的沉淀物中加入200μl DEPC處理水（無核水）溶解沉淀物，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
（三）RNA檢測
1.在紫外分光光度計上檢測RNA濃度及純度。
方法同實驗四，用DEPC處理水校正零點；用DEPC處理水稀釋RNA樣品；讀取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。
2. 瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測
（1）制備凝膠（1.2%）。稱1.2g瓊脂糖，加72ml DEPC處理水，加熱熔化。冷卻至60℃，在通風(fēng)櫥內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛（37%）18ml，混勻后，倒膠。
（2）制備樣品。在離心管中，將RNA樣品與5×變性上樣緩沖液以4：1混勻。65℃溫育5～10min，迅速在冰上冷卻5min，離心數(shù)秒。
（3）上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品卷入上樣孔。以5V/cm的電壓電泳1.5～2h.。
（4）待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長度的2/3～4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙啶溶液（0.5μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色約30min。
（5）在凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析。
四、注意事項
1.RNA是極易降解的核酸分子。因此提取總RNA必須在無RNase 環(huán)境中，戴口罩、手套、使用無RNase污染的試劑、材料、容器。
2.所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05%～0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理或加熱至70℃ 1 小時或60℃過夜，以除去石油殘留的DEPC。
3.所用的化學(xué)試劑應(yīng)為新包裝，稱量時使用干烤處理的稱量勺，所有操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，低溫條件可減低RNA酶活性。
4.根據(jù)RNA樣品的紫外吸收OD值，可計算出RNAd 濃度。
單鏈RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀釋倍數(shù)
純RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,說明有蛋白質(zhì)等污染，應(yīng)用酚/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有鹽、胍、糖可用LiCL選擇沉淀RNA以除去雜質(zhì)。
5.RNA樣品電泳后，可見28S、18S及5S小分子RNA條帶，則說明完整性好。若有降解可能是操作不當(dāng)或污染了RNase.。28S和18S RNA比值約為2：1,表明RNA無降解。如比值逆轉(zhuǎn)，則表明RNA降解。電泳中如果在28S 后方還有條帶，表明有DNA污染，應(yīng)用DNase處理后再進(jìn)行純化。
主要參考書：
1..金冬雁等譯.分子克隆實驗指南. 第二版.北京：科學(xué)出版社，1995
2.子穎等譯.精編分子生物學(xué)實驗指南. 科學(xué)出版，
3.周俊宜編.分子生物學(xué)基本技能和策略. 科學(xué)出版社
4.姜泊等編.分子生物學(xué)常用實驗方法.北京：人民軍醫(yī)出版社，1996.
5.劉進(jìn)元等編.分子生物學(xué)實驗指導(dǎo).北京：清華大學(xué)出版社，2002.
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